耐辐射异常球菌过氧化物酶OsmC与Ohr的功能研究

摘要

过氧化物酶（Peroxiredoxin，简写为Prx）是一种普遍存在于生物体中用于清除过氧化物的物质。细菌等微生物中的Prx可以分成两类:含两个半胱氨酸的过氧化物酶(2-CysPrx)和只含一个半胱氨酸的过氧化物酶(1-CysPrx)。耐辐射异常球菌是一种具有超强电离辐射抗性的微生物，且对氧化、干旱和高盐胁迫也具有极强的耐受力。异常球菌基因组中的DR1538和DR_1857两个基因分别编码了OsmC和Ohr蛋白，这两个蛋白均属于2-CysPrx。我们主要通过构建基因缺失突变株、胁迫表型鉴定、转录水平表达分析、蛋白纯化和体外酶活测定等方法来研究OsmC和Ohr蛋白的功能。实验结果如下:
　　通过对osmC和ohr两个基因进行生物信息学分析，结果表明:osmC基因全长441bp，编码146个氨基酸残基（aa），蛋白质的分子量大小约为15.7kDa;ohr基因长420bp，编码139aa，蛋白质的分子量为14.5kDa;氨基酸结构域分析结果表明OsmC和Ohr同属于OsmC超家族;多序列氨基酸的同源比对结果表明，OsmC与Ohr亚家族蛋白之间只有约20％的同源性，两个亚家族各自的同源性为40％-60％，;OsmC和Ohr蛋白的二级结构都主要是由α-螺旋及不规则卷曲组成的，两个蛋白都为亲水性蛋白;并运用同源建模方法对未知结构蛋白OsmC进行了三维结构预测。
　　通过体外三段融合PCR技术和线性转化方法构建了耐辐射异常球菌ΔosmC与Δohr突变株。从野生型菌株、ΔosmC与Δohr突变株在正常条件下的生长情况可以看出三株菌的生长差异并不显著，表明osmC基因与ohr基因并不影响耐辐射异常球菌菌株的生长;野生型菌株、ΔosmC和Δohr突变株在几种不同胁迫冲击(H2O2、CHP、山梨醇、NaCl和乙醇)下的表型鉴定结果表明ΔosmC突变株对H2O2胁迫冲击极端的敏感，对过氧化异丙苯(CHP)冲击并不敏感，而Δohr突变株对CHP的冲击敏感，对H2O2的冲击并不敏感，而三个菌株在其他胁迫（山梨醇、NaCl、乙醇）冲击下的表型差异并不明显。
　　在上述几种胁迫冲击条件下，野生型菌株中的osmC基因与ohr基因的的相对表达量测定结果表明，osmC基因受到了H2O2的显著诱导，与未处理菌株相比，表达量上升了约8.9倍，而osmC基因在其他胁迫下的相对表达量上升不明显;ohr基因在几种胁迫(H2O2、CHP、NaCl)冲击下的相对表达量都上升了约2倍。
　　通过构建pET28a-osmC、pTWIN1-ohr重组表达菌株，我们获得了纯化的OsmC蛋白与Ohr蛋白，并对两者在体外的底物降解速率进行了测定，结果表明OsmC和Ohr蛋白都能降解H2O2与CHP，其中OsmC蛋白降解H2O2的速率要大于降解CHP的速率，与之相反的是，Ohr蛋白降解CHP的速率要大于降解H2O2的速率。
　　以上实验结果表明OsmC蛋白与Ohr蛋白在体外选择底物的偏好性并不一致，OsmC偏好选择H2O2，Ohr偏好有机过氧化物。而它们在体内的底物选择和具体活性位点还需要进一步研究。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 过氧化物酶

1．1．1 过氧化物酶的主要功能

1．1．2 过氧化物酶的一般分类及作用机理

1．2 微生物中过氧化物酶的相关研究

1．2．1 细菌中烷基氢过氧化酶AhpC的研究

1．2．2 细菌中硫醇过氧化物酶Tpx

1．2．3 细菌中渗透诱导蛋白OsmC的研究

1．2．4 OsmC的调控

1．3 细菌中Ohr蛋白(有机过氧化物抗性蛋白)的研究

1．3．1 Ohr(有机氢过氧化物抗性蛋白)的结构与生物化学性质

1．3．2 OhrR介导的Ohr调控系统

1．3．3 非OhrR介导的Ohr调控系统

1．4 耐辐射异常球菌的相关研究进展

1．4．1 耐辐射异常球菌中与抗氧化作用相关的物质

1．4．2 耐辐射异常球菌过氧化物酶OsmC与Ohr

1．5 立题依据与研究意义

1．6 技术路线

2 耐辐射异常球菌中osmC与ohr基因的相关生物信息学分析

2．1 材料与方法

2．1．1 数据库与在线预测网站

2．1．2 分析软件

2．2 结果

2．2．1 osmC和ohr在基因组中的位置

2．2．2 OsmC和Ohr蛋白的氨基酸序列分析

2．2．3 OsmC蛋白与Ohr蛋白的二级结构预测

2．2．4 OsmC蛋白与Ohr蛋白的跨膜结构域预测

2．2．5 蛋白的三级结构预测

2．3 讨论

3．耐辐射异常球菌△osmC、△ohr突变株的构建及表型鉴定

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株、质粒

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．1．4 基因组DNA的提取

3．1．5 大肠杆菌质粒DNA的提取

3．1．6 引物设计与PCR反应程序

3．1．7 PCR产物纯化与琼脂糖凝胶回收

3．1．8 连接与酶切

3．1．9 转化(大肠杆菌感受态和耐辐射异常球菌野生型)

3．1．10 菌体RNA提取

3．1．11 消化与反转录

3．1．12 实时荧光定量PCR

3．1．13 生长曲线的测定

3．1．14 H2O2对菌株的冲击实验

3．1．15 CHP(过氧化异丙苯)对菌株的冲击实验

3．1．16 NaCl溶液对菌株的盐冲击实验

3．1．17 山梨醇溶液对菌株的冲击实验

3．1．18 乙醇对菌株的冲击实验

3．2 实验结果

3．2．1 △osmC、△ohr突变株的构建

3．2．2 正常条件下不同菌株的生长情况

3．2．3 菌株生长状况受不同浓度H2O2冲击的影响

3．2．4 不同浓度的过氧化异丙苯(CHP)冲击对菌株的影响

3．2．5 其他胁迫对菌株的影响

3．2．6 osmC与ohr基因在不同胁迫条件下的表达量

3．3 讨论

4．OsmC与Ohr蛋白的表达纯化及酶活测定

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株、质粒、培养基

4．1．2 主要试剂与仪器

4．1．3 所需溶液

4．1．4 耐辐射异常球菌基因组的提取

4．1．5 PCR反应

4．1．6 普通DNA纯化试剂盒

4．1．7 大肠杆菌质粒的提取

4．1．8 载体构建

4．1．9 H2O2冲击对大肠杆菌重组菌株的影响

4．1．10 CHP冲击对大肠杆菌重组菌株的影响

4．1．11 OsmC蛋白的表达和纯化

4．1．12 Ohr蛋白的诱导表达和纯化

4．1．13 聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳

4．1．14 OsmC蛋白与Ohr蛋白的酶活测定

4．2 结果与分析

4．2．1 Z3-osmC、Z3-ohr重组菌株的构建及表型

4．2．2 OsmC蛋白的表达纯化

4．2．3 Ohr蛋白的表达纯化

4．2．4 OsmC蛋白与Ohr蛋白的酶活测定

4．3 讨论

结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文