CFPS-M及CFPS-2M基因在拟南芥中的过表达及抗逆性研究

摘要

耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）是迄今为止发现的辐射耐受性最强的生物之一，CFPS是位于耐辐射奇球菌R1属的一段基因。通过NCBI数据比对发现CFPS与LEA76基因家族同源，属于LEA第三族的基因。第三族LEA蛋白基因包含多个拷贝的11个氨基酸组成的基元序列(TAQAAKEKAGE)。本研究将耐辐射奇球菌CFPS全长基因分为5个结构域，其中含有11个氨基酸重复区段的第104位至160位氨基酸结构域，命名为CFPS-M；含有双倍CFPS-M基因的串联序列，命名为 CFPS-2M。我们构建了植物表达载体 PCAMBIA2300-M和PCAMBIA2300-2M,分别将两个基因转入拟南芥中，获得T3代转基因阳性苗，并对其进行了多种非生物胁迫下的抗逆性研究分析。主要结果如下：
　　（1）成功构建植物表达载体PCAMBIA2300-M和PCAMBIA2300-2M，并用冻融法将它们分别导入农杆菌GV3103中，经Kan抗性筛选和菌落PCR鉴定成功导入农杆菌中。
　　（2）选择拟南芥作为受体材料，用农杆菌介导法将CFPS-M和CFPS-2M基因转入拟南芥中，经Kan抗性筛选和对基因组DNA进行PCR鉴定，以及实时荧光定量PCR鉴定，筛选到18株转CFPS-M基因阳性苗和21株转CFPS-2M基因阳性苗，并不断繁育筛选到T3代纯合阳性苗。
　　（3）在多种非生物胁迫下，转基因拟南芥种子的相对发芽率和相对根长都大于非转基因植株（P<0.05）。并且包含双拷贝的CFPS-M基因的CFPS-2M转基因拟南芥抗逆能力更强，在干旱、盐渍、高温、低温等非生物胁迫下均较为突出。
　　（4）在多种非生物胁迫下，转基因拟南芥成苗的生理生化指标分析表明转基因植株的丙二醛含量比野生型对照显著降低（P<0.05），可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸等渗透调节物质的含量显著高于非转基因植株（P<0.05），且抗氧化酶系统（SOD、POD、CAT）的活性也显著高于野生型对照（P<0.05）。说明CFPS-M和CFPS-2M基因通过降低植物体内积累的有害物质MDA的含量及提高植物体内渗透调节保护物质含量、抗氧化酶系统的活力来提高植物抵御非生物胁迫的能力。
　　（5）转CFPS-2M基因拟南芥植株的抗逆性比转CFPS-M基因植株的抗逆性更强，说明增加了外源抗逆基因的拷贝数增强了该抗逆基因表达的效果，使植株有更强的抗逆性。

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1 绪 论

1.1 引 言

1.2 国内外研究进展

1.2.1 非生物胁迫对植物的影响

1.2.2 植物抗非生物胁迫的机制

1.2.3 植物抗非生物胁迫基因工程研究进展

1.2.4 CFPS-M、CFPS-2M基因的研究背景

1.3 拟南芥简述

1.4 研究目的和意义

1.5 主要研究内容和技术路线

1.5.1 构建PCAMBIA2300-M及PCAMBIA2300-2M植物表达载体并转化获得GV3103-M、GV3103-2M农杆菌

1.5.2 农杆菌介导 CFPS-M及CFPS-2M基因转化哥伦比亚型拟南芥

1.5.3 非生物胁迫下转基因拟南芥抗逆性研究

2CFPS-M、CFPS-2M基因转化拟南芥的转基因研究

2.1 材料

2.1.1 菌种

2.1.2 植物材料

2.1.3 主要培养基

2.1.4 主要试剂

2.1.5 主要仪器及设备

2.1.6 主要缓冲液

2.2 方法

2.2.1 构建PCAMBIA2300-M及PCAMBIA2300-2M植物表达载体

2.2.2 花序侵染法转化拟南芥

2.2.3 转基因拟南芥植株的鉴定

2.2.4 转基因拟南芥植株的实时荧光定量(Real-time)PCR检测

2.3 结果与分析

2.3.1 PCAMBIA2300-M及PCAMBIA2300-2M质粒的构建

2.3.2 GV3103-M及GV3103-2M农杆菌的获得

2.3.3 转基因拟南芥的筛选与检测

2.3.4 T3代转基因拟南芥的定量检测

2.4 本章小结与讨论

3 转CFPS-M、CFPS-2M基因拟南芥在非生物胁迫下的抗逆性研究

3.1 研究材料

3.2 试剂

3.3 研究方法

3.3.1 非生物胁迫下转基因拟南芥萌发能力的分析

3.3.2 非生物胁迫下转基因拟南芥成苗的抗逆分析

3.3.3 相关生理生化指标测定

3.4 结果与分析

3.4.1 非生物胁迫下转基因拟南芥萌发能力的分析

3.4.2 非生物胁迫下转基因拟南芥成苗的抗逆性分析

3.5 本章小节与讨论

结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文及研究成果