拟南芥At-ACA8基因在增强植物抗逆性和调控植物生长发育中的应用

摘要

提供一种拟南芥钙离子转运-ATP酶基因At-ACA8的应用，包括该基因在调控植物生长发育和抗逆境胁迫方面的应用，以及该基因在培育抗逆境胁迫转基因植物品种方面的应用。利用从拟南芥生物资源中心获得的At-ACA8基因T-DNA插入突变体aca8为对象，实验结果证实该突变体对低温、高温、渗透胁迫等逆境有显著抗性；种子萌发阶段对有无蔗糖较敏感，不添加蔗糖的情况下种子萌发会受到严重抑制，而生长阶段对蔗糖浓度的升高较敏感；种子萌发阶段对激素ABA敏感，施加少量ABA会显著抑制种子萌发。本发明揭示了钙离子信号转导系统调控植物生长发育和抗胁迫的应答功能，为植物品种改良提供了一个优质基因，阐述了一种新的提高植物抵抗逆境能力并培育具优良抗性品种的方法和机制，具有重要的经济意义和运用价值。

说明书

技术领域：

本发明属于植物基因工程领域，具体地，涉及一种拟南芥钙离子转运-ATP酶蛋白基因At-ACA8的运用，涉及基因At-ACA8的突变体aca8在提高植物抗低温、高温、渗透胁迫及激素响应方面和调控植物生长发育上的应用，同时，还涉及该基因At-ACA8在培育具有多种胁迫抗性、对无蔗糖及高浓度蔗糖敏感以及种子萌发阶段对激素ABA敏感的转基因植物品种方面的应用。

背景技术：

植物的生长发育和它们所存在的环境紧密相关。自然界中，由于不同的地理位置、气候条件以及人类活动等多方面原因，造成了各种逆境，植物常在不利的环境条件下生长，如干旱、水涝、盐害、低温、高温、病虫害等。对农业生产来说，各种逆境是影响作物产量和品质最直接、最重要的因素。因此，加强植物抗性生理的研究，探明植物在逆境下的生命活动规律并加以人为调控，培育具有抵抗不良环境性状的优良品种，以提高作物的产量和品质，对于获得农业高产稳产具有重要意义。

植物具有对环境变化快速感知和主动适应的能力。植物通过细胞感受逆境信号、传导逆境刺激、激活一系列分子途径并调控相关基因的表达和生理反应等3个阶段适应逆境，在逆境中获得抗逆性。抗性基因对外界胁迫因子的识别，需要细胞内准确而敏感的信号系统为基础。一些研究表明，在逆境下植物体内存在系统性传递信息的信号物，目前发现的主要信号分子有Ca²⁺、蛋白激酶、H⁺(pH)、ABA、ROS和NO等，它们作为信号传递者，参与植物抗逆反应。

Ca²⁺作为植物细胞信号转导过程中的第二信使已得到广泛认可。植物细胞中在胞基质与胞外或胞内钙库(某些细胞器)间存在一个很大的Ca²⁺浓度极差。研究证实，各种不同的胞外刺激信号，如干旱和盐胁迫、热激、低温、氧化胁迫及缺氧等均可能引起植物细胞内游离Ca²⁺浓度的变化，引起Ca²⁺在细胞内的梯度分布或分布区域化。胞内游离Ca²⁺浓度的变化主要是通过Ca²⁺的跨膜运转或钙螯合物的调节实现的，已经在质膜、液泡膜、内质网膜上发现了钙离子泵、钙离子通道以及Ca²⁺/H⁺交换系统的存在。各种胞外刺激信号可能直接或间接的调节这些钙运输系统，从而引起胞内游离Ca²⁺浓度的变化，并导致不同的细胞反应。

钙离子泵(calcium pump)亦称为Ca²⁺-ATP酶(Ca²⁺-ATPase)，对于细胞中Ca²⁺信号的传导非常重要，属于P型ATP酶超基因家族，根据蛋白序列同源性原则又划分为两个独特的钙泵家族IIA和IIB基因家族，这两个家族中的成员分别包括内质网膜型钙离子泵(ECA型)和自抑制型钙离子泵(ACA型)。在拟南芥中，目前总共发现了4个ECA型钙离子泵编码基因和10个ACA型钙离子泵编码基因。

At-ACA8基因是ACA型钙离子泵基因家族中的一个重要成员，定位于质膜上，行使通过利用ATP水解释放的能量将胞质内的Ca²⁺泵至胞外的功能，并且与家族中的另外两个成员At-ACA9和At-ACA10基因有较高的序列同源性。之前的研究发现，At-ACA8和At-ACA10基因在拟南芥的所有器官中都有表达，At-ACA9基因只在花中表达，施加激素ABA会快速激活幼苗中At-ACA8和At-ACA10基因的表达；拟南芥At-ACA9基因功能的缺失，会显著影响花粉管伸张以及产生部分雄性不育；At-ACA10基因则调控了植物营养生长阶段的伸长生长，并对花序结构的正常发育起决定性作用。有关At-ACA8基因的研究主要集中于N端自抑制蛋白结构域的氨基酸组成和自抑制功能，其调控植物生长发育阶段的细胞生物学作用还没有过报道。

发明内容：

本发明目的在于提供一种拟南芥钙离子转运-ATP酶基因At-ACA8在调控植物生长发育和抗胁迫方面的应用。

本发明的目的还在于提供一种拟南芥基因At-ACA8在培育抗逆转基因植物方面的应用。

同时，本发明的目的还在于提供了一种拟南芥基因At-ACA8及拟南芥At-ACA8基因T-DNA插入突变体aca8在培育具有对无蔗糖及高浓度蔗糖敏感，种子萌发阶段对激素ABA敏感，施加少量ABA显著抑制种子萌发的转基因植物方面的应用。

本发明的技术方案是这样来实现的：

拟南芥的钙离子转运-ATP酶基因At-ACA8在提高植物抗逆境能力中的应用。

拟南芥的钙离子转运-ATP酶基因At-ACA8在调控植物生长发育中的应用。

拟南芥基因At-ACA8在培育抗低温的转基因植物中的应用。

拟南芥基因At-ACA8在培育抗高温的转基因植物中的应用。

拟南芥基因At-ACA8在培育抗干旱胁迫的转基因植物中的应用。

拟南芥基因At-ACA8在培育对无蔗糖及高浓度蔗糖敏感的转基因植物中的应用。

拟南芥基因At-ACA8在培育种子萌发阶段对激素ABA敏感，低浓度ABA显著抑制种子萌发的转基因植物中的应用。

拟南芥At-ACA8基因T-DNA插入突变体aca8在培育抗低温的转基因植物中的应用。

拟南芥At-ACA8基因T-DNA插入突变体aca8在培育抗高温的转基因植物中的应用。

拟南芥At-ACA8基因T-DNA插入突变体aca8在培育抗干旱胁迫的转基因植物中的应用。

拟南芥At-ACA8基因T-DNA插入突变体aca8在培育对无蔗糖及高浓度蔗糖敏感的转基因植物中的应用。

拟南芥At-ACA8基因T-DNA插入突变体aca8在培育种子萌发阶段对激素ABA敏感，低浓度ABA显著抑制种子萌发的转基因植物中的应用。

上述的应用中，所述的转基因植物是将拟南芥中的At-ACA8基因以及来源于其他植物的同源基因，完整克隆或其中部分片断化，以及通过替换、增减碱基后连接到不同种类载体上，以及通过不同的表达载体转化获得不同抗性的转基因植物。

本发明的技术方案是基于下述的原理得出的：拟南芥At-ACA8基因的一种T-DNA突变体aca8对多种环境胁迫(低温、高温和渗透胁迫)有显著耐受作用；对有无蔗糖及高浓度的蔗糖变化敏感；种子萌发阶段对激素ABA敏感，施加少量ABA会显著抑制种子萌发。由此看出，At-ACA8基因在多种环境胁迫下均对植物的生命活动起到极其重要的调控作用，研究它作为钙离子泵调节植物抗逆境能力的作用，进一步从分子水平上阐明钙信号转导系统参与植物抗逆性反应的机制，对揭示植物感受各种逆境胁迫的机理提供具有实质性价值，且对农业生产和作物改良有重要的现实意义。

本发明应用Affymetrix ATH1芯片检测拟南芥响应低温冻害胁迫的三个典型阶段(冷驯、冻、融)转录水平上基因表达的变化。筛选发现在这三个阶段拟南芥Ca²⁺-ATP酶基因At-ACA8的表达量都发生了显著改变，尤其在冻融阶段基因的表达量明显上升，并且根据之前对Ca²⁺信号分子功能的阐述，说明此基因可能是植物响应低温胁迫的关键基因，在Ca²⁺介导的低温信号传导通路中发挥重要作用。

At-ACA8基因在GenBank中的编号是AT5G57110.1和AT5G57110.2，CDS序列长为3225bp，编码1074个氨基酸。用SMART程序分析预测At-ACA8蛋白，该蛋白含有如下重要的结构域，如图1所示：Ca²⁺-ATP酶N端的自抑制特征结构域(Ca²⁺-ATPase N terminalautoinhibitory domain，27-72位)，存在于真核生物中，由约50个氨基酸组成，含有保守的RRFR序列元件，Phe和Trp是两个保守的对功能行使起决定作用的氨基酸；阳离子转运体/ATP酶N端结构域(Cation transporter/ATPase N terminus，135-209位)；E1-E2ATP酶(223-472位)，也称P型ATP酶，主要功能是利用ATP水解产生的能量跨膜转运各种离子和磷脂；水解酶(Hydrolase，476-797位)结构域；阳离子转运体/ATP酶C端结构域(Cationtransporter/ATPase C terminus，867-1045位)，这个家族含有5个跨膜的螺旋结构。

本发明所述拟南芥Ca²⁺-ATP酶基因At-ACA8编码的蛋白主要定位于细胞质膜上，该基因主要在细胞质膜上行使Ca²⁺由胞内转运至胞外的功能。

本发明利用从拟南芥生物资源中心ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)获得的At-ACA8基因T-DNA插入突变体aca8(种子编号为CS859889)作为研究对象，发现该突变体对低温、高温、渗透胁迫等逆境条件有显著高于野生型的抵抗力，对无蔗糖及高浓度蔗糖敏感，种子萌发阶段对激素ABA敏感，施加少量ABA显著抑制种子萌发。

本发明的积极效果在于：

本发明所述的拟南芥Ca²⁺-ATP酶基因At-ACA8的相关生理实验证明，该基因参与植物生长发育调节和胁迫应答等过程，本发明对深入理解钙离子信号转导系统在调控植物生长发育和胁迫应答方面有实质性的价值；由于aca8突变体对低温、高温、渗透胁迫具有显著的抵抗力，并且以往的大量研究证明以拟南芥为材料所鉴定的大多数功能基因都能应用到其它植物的研究中，因此本发明还为植物品种的改良提供了一个优质基因，阐述了一种新的提高植物抵抗逆境能力并培育具有优良抗性品种的方法和机制，具有重要的经济意义和运用前景。

附图说明：

图1用SMART程序分析预测At-ACA8蛋白的结构域；

图2At-ACA8基因T-DNA插入突变体的鉴定；2A、T-DNA插入突变体aca8(CS889)的插入位点及PCR鉴定引物设计示意图；2B、T-DNA插入突变体aca8(CS889)的纯合子PCR鉴定电泳图；2C、22℃正常生长的野生型与突变体aca8叶片中At-ACA8基因转录水平半定量RT-PCR鉴定；

图3低温胁迫处理突变体aca8的抗性分析；3A低温胁迫处理无菌苗Col-0和aca8表型及光系统II最大光化学量子产量(Fv/Fm)变化；3B、低温胁迫处理土培苗Col-0和aca8表型；3C、低温胁迫处理土培苗Col-0和aca8叶片光系统II最大光化学量子产量(Fv/Fm)变化；3D、低温胁迫处理Col-0和aca8土培苗叶片中低温响应基因转录水平半定量RT-PCR分析；

图4高温胁迫处理突变体aca8的抗性分析；4A、高温胁迫处理Col-0和aca8无菌苗表型及光系统II最大光化学量子产量(Fv/Fm)变化；4B、高温胁迫处理Col-0和aca8土培苗表型；4C、高温胁迫处理Col-0和aca8土培苗叶片光系统II最大光化学量子产量(Fv/Fm)变化；

图5干旱胁迫处理突变体aca8的抗性分析；5A、22℃长期脱水Col-0和aca8土培苗表型；5B.不同浓度的PEG模拟干旱处理Col-0和aca8表型；

图6不同浓度的ABA处理Col-0和aca8的种子萌发情况和绿芽率分析；

图7不同浓度的蔗糖处理Col-0和aca8的种子萌发情况和绿芽率分析。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

实施例1：

At-ACA8基因纯合突变体aca8的筛选和基因表达量检测：

(一)At-ACA8基因纯合突变体aca8的筛选：

At-ACA8基因(序列表如表1、表2、表3所示)的拟南芥T-DNA插入突变体(种子编号为CS859889)，通过PCR鉴定纯合突变株，如图2A所示，所用引物如下：5’端引物：5’-CTTCAACGCCTTTGTTCTCTG-3’；3’端引物：5’-CCAGTAATCCAAAGTTGCTCG-3’；LBpROK2：5’-ATTTTGCCGATTTCGGAA C-3’，进一步的测序验证发现该突变体源于T-DNA插入第34号外显子中，而导致基因突变。结果如图2B所示，鉴定CS889均为纯合子。

(二)Col-0与突变体aca8叶片中At-ACA8基因转录水平的半定量RT-PCR鉴定：

提取正常22℃下生长约3周大小拟南芥土培苗叶片的总RNA，进行半定量RT-PCR分析。所用At-ACA8基因引物为：F：5’-GATGCTCCTGCATTGCACGA-3’，R：5’-CGAGAGCGGCGACATTGACT-3’；Actin基因引物为：F：5’-TGTGCCAATCTACGAGGGTTT-3’，R：5’-TTTCCCGCTCTGCTGTTGT-3’。结果如图2C所示，在不同的高、低温处理条件下aca8与Col-0中At-ACA8基因的表达量存在显著差异，表明T-DNA的插入，已导致突变体中At-ACA8基因的转录水平表达发生了不同于野生型的改变，从而确定了At-ACA8基因参与植物对高、低温胁迫的响应过程。

本试验中，基因At-ACA8存在两个转录本，GenBank中的编号是AT5G57110.1和AT5G57110.2，CDS序列长为3225bp，编码1074个氨基酸，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示。利用从拟南芥生物资源中心ABRC(Arabidopsis BiologicalResource Center)获得的At-ACA8基因T-DNA插入的拟南芥突变体aca8作为研究对象，突变体株系的种子编号为CS859889，突变体aca8源于载体pROK2上的一段T-DNA插入基因At-AC48的第34外显子中，导致基因突变，插入位点处的侧翼序列如SEQ ID No 3所示。

表1At-ACA8基因核苷酸序列表

1     ATGACGAGTC  TCTTGAAGTC  ATCGCCTGGA  CGACGCCGTG  GAGGCGATGT

51    GGAGTCTGGG  AAGAGTGAAC  ACGCAGACTC  TGATAGCGAC  ACTTTCTACA

101   TCCCATCGAA  GAATGCTTCT  ATTGAGCGGC  TTCAACAGTG  GAGAAAAGCT

151   GCACTGGTTC  TCAATGCGTC  CCGGAGATTC  CGGTACACCT  TGGACTTGAA

201   GAAGGAGCAA  GAAACGAGGG  AAATGAGACA  GAAGATCAGA  AGTCATGCTC

251   ATGCTCTTTT  GGCGGCGAAT  CGTTTTATGG  ATATGGGACG  TGAGTCAGGA

301   GTTGAAAAAA  CAACTGGGCC  TGCAACTCCG  GCTGGTGATT  TTGGAATTAC

351   TCCTGAACAG  CTTGTGATAA  TGTCAAAGGA  TCACAACAGT  GGTGCCCTGG

401   AGCAATATGG  AGGGACTCAA  GGATTGGCCA  ATTTGCTCAA  GACAAATCCA

451   GAGAAAGGTA  TCAGTGGCGA  TGATGATGAC  TTGCTAAAGC  GCAAGACCAT

501   TTATGGATCA  AACACATATC  CTCGCAAGAA  AGGGAAAGGG  TTTCTGAGGT

551   TTCTTTGGGA  TGCTTGCCAT  GATCTCACCT  TGATCATTTT  AATGGTTGCT

601   GCTGTAGCGT  CTTTAGCACT  TGGGATAAAA  ACAGAGGGTA  TCAAAGAAGG

651   ATGGTATGAT  GGAGGAAGCA  TTGCATTTGC  TGTGATTCTT  GTGATTGTTG

701   TGACGGCTGT  CAGTGACTAC  AAACAGTCGC  TCCAGTTTCA  AAACTTGAAT

751   GATGAAAAGA  GAAACATACA  TCTGGAGGTG  TTAAGAGGTG  GAAGACGAGT

801   GGAGATTTCG  ATCTATGACA  TAGTGGTGGG  TGATGTCATT  CCTCTCAACA

851   TTGGCAATCA  GGTTCCTGCT  GATGGAGTAC  TGATATCTGG  CCACTCTCTC

901   GCCCTTGATG  AATCTAGCAT  GACTGGAGAG  AGCAAAATTG  TTAACAAAGA

951   CGCTAACAAG  GACCCATTCT  TAATGTCTGG  CTGTAAAGTG  GCAGATGGAA

1001  ATGGTTCTAT  GCTGGTTACT  GGTGTTGGAG  TCAACACTGA  ATGGGGATTG

1051  CTGATGGCCA  GTATTTCTGA  AGACAATGGT  GAAGAAACTC  CCTTGCAGGT

1101  GCGCTTAAAT  GGGGTAGCTA  CTTTTATTGG  TTCAATTGGC  TTAGCGGTGG

1151  CTGCTGCTGT  GCTAGTGATT  CTTCTGACTC  GATATTTCAC  TGGTCACACT

1201  AAAGACAATA  ATGGAGGTCC  TCAATTCGTT  AAAGGCAAGA  CAAAAGTCGG

1251  TCATGTTATT    GATGATGTGG    TCAAAGTCCT    TACCGTAGCG    GTTACAATTG

1301  TCGTAGTGGC    AGTGCCTGAG    GGTCTTCCTT    TGGCTGTTAC    TTTAACCCTT

1351  GCCTATTCAA    TGAGGAAAAT    GATGGCAGAT    AAGGCTTTGG    TGCGGAGGCT

1401  ATCTGCTTGC    GAGACAATGG    GCTCTGCCAC    CACTATTTGC    AGCGATAAAA

1451  CTGGAACACT    AACTCTGAAT    CAGATGACTG    TGGTTGAGTC    TTATGCTGGG

1501  GGCAAGAAAA    CAGATACTGA    ACAATTGCCA    GCAACTATCA    CTTCGCTAGT

1551  AGTTGAAGGA    ATATCTCAAA    ACACAACTGG    TAGTATTTTT    GTCCCAGAGG

1601  GTGGAGGTGA    TTTAGAGTAC    TCTGGTTCAC    CAACAGAAAA    GGCCATTCTT

1651  GGCTGGGGAG    TTAAGCTGGG    AATGAATTTC    GAGACAGCCC    GATCGCAGTC

1701  TTCTATTCTT    CATGCTTTTC    CATTTAACTC    AGAGAAGAAA    CGTGGTGGTG

1751  TTGCTGTAAA    AACGGCTGAT    GGTGAAGTTC    ATGTTCACTG    GAAAGGAGCT

1801  TCTGAAATTG    TCCTGGCATC    ATGCCGAAGC    TACATCGATG    AGGATGGTAA

1851  TGTGGCACCA    ATGACTGACG    ACAAGGCATC    GTTTTTCAAG    AATGGCATTA

1901  ATGATATGGC    TGGAAGAACC    TTACGATGTG    TTGCACTCGC    CTTTAGAACC

1951  TATGAGGCTG    AAAAGGTCCC    AACAGGCGAA    GAGCTCTCAA    AGTGGGTACT

2001  CCCAGAGGAT    GATCTTATAT    TATTAGCTAT    AGTGGGCATA    AAGGATCCAT

2051  GTAGACCAGG    AGTCAAAGAT    TCAGTTGTGT    TGTGTCAAAA    TGCTGGTGTC

2101  AAGGTCCGTA    TGGTTACTGG    TGACAACGTC    CAAACTGCCA    GGGCTATTGC

2151  CTTGGAATGT    GGAATACTAA    GTTCAGATGC    AGATCTCTCC    GAGCCTACTC

2201  TCATTGAAGG    AAAATCATTC    CGTGAGATGA    CTGATGCAGA    AAGGGACAAG

2251  ATTAGTGACA    AAATATCGGT    TATGGGCCGA    TCATCTCCCA    ATGACAAACT

2301  TCTGCTGGTA    CAATCTCTGA    GACGACAAGG    GCATGTTGTT    GCTGTCACCG

2351  GGGATGGGAC    AAATGATGCT    CCTGCATTGC    ACGAGGCAGA    TATTGGTCTT

2401  GCTATGGGAA    TAGCAGGAAC    AGAAGTGGCT    AAGGAGAGTT    CGGACATCAT

2451  CATCTTGGAT    GACAACTTTG    CTTCAGTTGT    CAAGGTTGTT    CGATGGGGGC

2501  GATCAGTGTA    TGCCAACATT    CAGAAGTTCA    TCCAATTTCA    GCTCACAGTC

2551  AATGTCGCCG    CTCTCGTAAT    TAATGTTGTA    GCTGCTATTT    CGAGTGGTGA

2601  CGTTCCACTT    ACCGCTGTGC    AGCTTCTCTG    GGTTAATCTG    ATAATGGACA

2651  CTCTTGGAGC    ATTGGCTTTG    GCTACTGAAC    CACCCACTGA    TCACCTCATG

2701  GGGAGGCCTC    CAGTTGGCAG    AAAAGAACCT    CTTATTACCA    ACATCATGTG

2751  GAGAAACTTG    CTGATCCAGG    CTATTTATCA    AGTGAGTGTA    TTGTTAACAC

2801  TCAATTTCCG    AGGCATAAGC    ATACTTGGCC    TGGAGCATGA    AGTGCATGAA

2851  CACGCCACTA    GAGTGAAGAA    CACAATAATC    TTCAACGCCT    TTGTTCTCTG

2901  CCAAGCTTTC    AATGAGTTCA    ATGCTCGTAA    ACCAGATGAG    AAGAACATCT

2951  TCAAAGGTGT    GATCAAGAAT    CGTCTCTTTA    TGGGAATAAT    AGTCATAACT

3001  CTTGTGCTCC    AGGTTATCAT    TGTTGAGTTC    CTTGGTAAAT    TCGCTTCCAC

3051  GACGAAACTA    AACTGGAAGC    AATGGCTTAT    CTGTGTTGGC    ATCGGTGTTA

3101  TCAGTTGGCC    TCTTGCTTTG    GTCGGGAAAT    TCATTCCGGT    GCCTGCAGCT

3151  CCTATAAGCA    ACAAATTGAA    AGTACTAAAA    TTCTGGGGCA    AGAAGAAAAA

3201  TTCTTCTGGA    GAAGGTTCAC    TCTGA(Length：3225bp)

表2At-ACA8基因氨基酸序列表

1    Met Thr Ser Leu Leu Lys Ser Ser Pro Gly Arg Arg Arg Gly Gly Asp Val Glu Ser Gly

21   Lys Ser Glu His Ala Asp Ser Asp Ser Asp Thr Phe Tyr Ile Pro Ser Lys Asn Ala Ser

41   Ile Glu Arg Leu Gln Gln Trp Arg Lys Ala Ala Leu Val Leu Asn Ala Ser Arg Arg Phe

61   Arg Tyr Thr Leu Asp Leu Lys Lys Glu Gln Glu Thr Arg Glu Met Arg Gln Lys Ile Arg

81   Ser His Ala His Ala Leu Leu Ala Ala Asn Arg Phe Met Asp Met Gly Arg Glu Ser Gly

101  Val Glu Lys Thr Thr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Gly Asp Phe Gly Ile Thr Pro Glu Gln

121  Leu Val Ile Met Ser Lys Asp His Asn Ser Gly Ala Leu Glu Gln Tyr Gly Gly Thr Gln

141  Gly Leu Ala Asn Leu Leu Lys Thr Asn Pro Glu Lys Gly Ile Ser Gly Asp Asp Asp Asp

161  Leu Leu Lys Arg Lys Thr Ile Tyr Gly Ser Asn Thr Tyr Pro Arg Lys Lys Gly Lys Gly

181  Phe Leu Arg Phe Leu Trp Asp Ala Cys His Asp Leu Thr Leu Ile Ile Leu Met Val Ala

201  Ala Val Ala Ser Leu Ala Leu Gly Ile Lys Thr Glu Gly Ile Lys Glu Gly Trp Tyr Asp

221  Gly Gly Ser Ile Ala Phe Ala Val Ile Leu Val Ile Val Val Thr Ala Val Ser Asp Tyr

241  Lys Gln Ser Leu Gln Phe Gln Asn Leu Asn Asp Glu Lys Arg Asn Ile His Leu Glu Val

261  Leu Arg Gly Gly Arg Arg Val Glu Ile Ser Ile Tyr Asp Ile Val Val Gly Asp Val Ile

281  Pro Leu Asn Ile Gly Asn Gln Val Pro Ala Asp Gly Val Leu Ile Ser Gly His Ser Leu

301  Ala Leu Asp Glu Ser Ser Met Thr Gly Glu Ser Lys Ile Val Asn Lys Asp Ala Asn Lys

321  Asp Pro Phe Leu Met Ser Gly Cys Lys Val Ala Asp Gly Asn Gly Ser Met Leu Val Thr

341  Gly Val Gly Val Asn Thr Glu Trp Gly Leu Leu Met Ala Ser Ile Ser Glu Asp Asn Gly

361  Glu Glu Thr Pro Leu Gln Val Arg Leu Asn Gly Val Ala Thr Phe Ile Gly Ser Ile Gly

381  Leu Ala Val Ala Ala Ala Val Leu Val Ile Leu Leu Thr Arg Tyr Phe Thr Gly His Thr

401  Lys Asp Asn Asn Gly Gly Pro Gln Phe Val Lys Gly Lys Thr Lys Val Gly His Val Ile

421  Asp Asp Val Val Lys Val Leu Thr Val Ala Val Thr Ile Val Val Val Ala Val Pro Glu

441  Gly Leu Pro Leu Ala Val Thr Leu Thr Leu Ala Tyr Ser Met Arg Lys Met Met Ala Asp

461  Lys Ala Leu Val Arg Arg Leu Ser Ala Cys Glu Thr Met Gly Ser Ala Thr Thr Ile Cys

481  Ser Asp Lys Thr Gly Thr Leu Thr Leu Asn Gln Met Thr Val Val Glu Ser Tyr Ala Gly

501  Gly Lys Lys Thr Asp Thr Glu Gln Leu Pro Ala Thr Ile Thr Ser Leu Val Val Glu Gly

521  Ile Ser Gln Asn Thr Thr Gly Ser Ile Phe Val Pro Glu Gly Gly Gly Asp Leu Glu Tyr

541  Ser Gly Ser Pro Thr Glu Lys Ala Ile Leu Gly Trp Gly Val Lys Leu Gly Met Asn Phe

561  Glu Thr Ala Arg Ser Gln Ser Ser Ile Leu His Ala Phe Pro Phe Asn Ser Glu Lys Lys

581  Arg Gly Gly Val Ala Val Lys Thr Ala Asp Gly Glu Val His Val His Trp Lys Gly Ala

601  Ser Glu Ile Val Leu Ala Ser Cys Arg Ser Tyr Ile Asp Glu Asp Gly Asn Val Ala Pro

621  Met Thr Asp Asp Lys Ala Ser Phe Phe Lys Asn Gly Ile Asn Asp Met Ala Gly Arg Thr

641  Leu Arg Cys Val Ala Leu Ala Phe Arg Thr Tyr Glu Ala Glu Lys Val Pro Thr Gly Glu

661  Glu Leu Ser Lys Trp Val Leu Pro Glu Asp Asp Leu Ile Leu Leu Ala Ile Val Gly Ile

681  Lys Asp Pro Cys Arg Pro Gly Val Lys Asp Ser Val Val Leu Cys Gln Asn Ala Gly Val

701  Lys Val Arg Met Val Thr Gly Asp Asn Val Gln Thr Ala Arg Ala Ile Ala Leu Glu Cys

721  Gly Ile Leu Ser Ser Asp Ala Asp Leu Ser Glu Pro Thr Leu Ile Glu Gly Lys Ser Phe

741  Arg Glu Met Thr Asp Ala Glu Arg Asp Lys Ile Ser Asp Lys Ile Ser Val Met Gly Arg

761  Ser Ser Pro Asn Asp Lys Leu Leu Leu Val Gln Ser Leu Arg Arg Gln Gly His Val Val

781  Ala Val Thr Gly Asp Gly Thr Asn Asp Ala Pro Ala Leu His Glu Ala Asp Ile Gly Leu

801  Ala Met Gly Ile Ala Gly Thr Glu Val Ala Lys Glu Ser Ser Asp Ile Ile Ile Leu Asp

821  Asp Asn Phe Ala Ser Val Val Lys Val Val Arg Trp Gly Arg Ser Val Tyr Ala Asn Ile

841  Gln Lys Phe Ile Gln Phe Gln Leu Thr Val Asn Val Ala Ala Leu Val Ile Asn Val Val

861  Ala Ala Ile Ser Ser Gly Asp Val Pro Leu Thr Ala Val Gln Leu Leu Trp Val Asn Leu

881  Ile Met Asp Thr Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Thr Glu Pro Pro Thr Asp His Leu Met

901  Gly Arg Pro Pro Val Gly Arg Lys Glu Pro Leu Ile Thr Asn Ile Met Trp Arg Asn Leu

921  Leu Ile Gln Ala Ile Tyr Gln Val Ser Val Leu Leu Thr Leu Asn Phe Arg Gly Ile Ser

941  Ile Leu Gly Leu Glu His Glu Val His Glu His Ala Thr Arg Val Lys Asn Thr Ile Ile

961  Phe Asn Ala Phe Val Leu Cys Gln Ala Phe Asn Glu Phe Asn Ala Arg Lys Pro Asp Glu

981  Lys Asn Ile Phe Lys Gly Val Ile Lys Asn Arg Leu Phe Met Gly Ile Ile Val Ile Thr

1001 Leu Val Leu Gln Val Ile Ile Val Glu Phe Leu Gly Lys Phe Ala Ser Thr Thr Lys Leu

1021 Asn Trp Lys Gln Trp Leu Ile Cys Val Gly Ile Gly Val Ile Ser Trp Pro Leu Ala Leu

1041 Val Gly Lys Phe Ile Pro Val Pro Ala Ala Pro Ile Ser Asn Lys Leu Lys Val Leu Lys

1061 Phe Trp Gly Lys Lys Lys Asn Ser Ser Gly Glu Gly Ser Leu(Length：1074aa)

表3At-ACA8基因突变体侧翼序列表

SEQ ID No：3

1   ATTGAAAGTA  CTAAAATTCT  GGGGCAAGAA  GAAAAATTCT  TCTGGAGAAG

51  GTAATAGTAA  CTTACAGCTT  GTGATTATCN  ATGAACTAAA  TTCTTAAGAA

101 AAGTTTGGGG  TGGGCAACTT  GTGTAATAAA  ACTTATCCTG  AATTTAAACT

151 GTAATAAGGA  TTTGGTTTAA  GCT(Length：173bp)

实施例2：

突变体aca8对低温胁迫的抗逆性：

(一)野生型植株和突变体aca8的低温胁迫表型试验：

将Col-0和aca8种子经消毒后分区播种在含1.5％蔗糖浓度的MS培养基中，于4℃春化3天，之后进行正常萌发生长(温度22℃，湿度50％-60％，光周期10h光照/14h黑暗)，培养14天后的无菌苗进行低温冷驯冻融实验。处理条件为：4℃冷驯3天，快速降温到-6℃冻3.5h-4h，升温到4℃恢复培养一天，之后置于22℃正常培养，约3-5天后可观察到Col-0与aca8的表型差异。如图3A所示，低温处理后aca8的无菌苗存活率更高，结果表明突变体aca8的无菌苗更耐低温胁迫。

同时还使用约3周大小的土培苗进行低温胁迫实验，处理条件为：4℃冷驯7天，快速降温到-6℃冻1h，升温到4℃恢复培养一天，之后置于22℃正常培养。通过实时监测叶片的光系统II(PSII)最大光化学量子产量(Fv/Fm)的变化，来检验植株叶片的受伤程度和恢复情况。如图3B和3C所示，处理后aca8的土培苗叶片具有较强的荧光值，荧光恢复能力比Col-0更好，具有更高的存活率，结果表明突变体aca8的土培苗更耐低温胁迫。

(二)低温处理下野生型与aca8突变体中低温响应相关基因的转录表达：

将约3周大小的拟南芥土培苗进行低温胁迫处理，分别在正常22℃培养、4℃冷驯7天(4℃7d)、4℃冷驯7天后快速降温到-6℃冻1h(-6℃1h CA)、不冷驯直接快速降温到-6℃冻1h(-6℃1h D)四个点取样，提取叶片的总RNA进行半定量RT-PCR，分析低温响应基因LTI78的转录表达水平。LTI78基因引物为：F：5’-GTTGTCAGTTTCTCCGCC-3’，R：5’-CTTTGACTCTGTTCTCGGT-3’；ACTIN基因引物为：F：5’-TGTGCCAATCTACGAGGGTTT-3’，R：5’-TTTCCCGCTCTGCTGTTGT-3’。如图3D所示，低温胁迫响应基因LTI78的表达水平，在不同低温处理阶段的Col-0和aca8中存在显著差异，At-AC48基因的突变，影响了植物低温信号传导途径中相关基因的表达模式，再次直接证明At-AC48基因与植物的抗低温胁迫能力相关。

实施例3：

突变体aca8对高温胁迫的抗逆性：

(一)野生型植株和突变体aca8的高温胁迫表型试验：

将Col-0和aca8种子经消毒后分区播种在含1.5％蔗糖浓度的MS培养基中，于4℃春化3天，然后正常萌发生长(温度22℃，湿度50％-60％，光周期10h光照/14h黑暗)，培养14天后的无菌苗进行高温热驯热激处理，条件为：38℃热驯2h，置于室温22℃恢复1h，升温到45℃热激3-4h，之后置于22℃恢复培养。约3-5天后可观察到野生型Col-0与突变体aca8的表型差异，如图4A所示，高温处理后aca8无菌苗存活率更高，表明突变体aca8的无菌苗更耐高温，热激后的恢复能力强于野生型。

同时还使用约3周大小的土培苗也进行了高温胁迫实验，条件为：38℃热驯2h，置于室温22℃恢复1h，升温到45℃梯度热激2.5-4h，之后置于22℃恢复培养，通过实时监测叶片的光系统II最大光化学量子产量(Fv/Fm)的变化，来检验植株的受伤程度和恢复情况。如图4B和4C所示，相同处理条件下，aca8土培苗的存活率更高，不同的高温梯度处理aca8都比Col-0表现出更强的荧光值，受伤害程度弱以及较好的恢复能力，结果表明突变体aca8的土培苗更耐高温胁迫。

实施例4：

突变体aca8对干旱胁迫的抗逆性：

(一)野生型植株和突变体aca8土培苗的脱水复水表型试验：

将约正常生长3周大小的土培苗Col-0和aca8，持续干旱处理14天后，发现Col-0和aca8植株均出现萎焉症状，Col-0的萎焉程度较严重，浇水恢复4天后发现，aca8植株100％能恢复正常生长，Col-0植株只有75％能恢复正常生长，如图5A所示，这表明aca8植株更耐水分亏缺。

(二)PEG模拟干旱处理野生型和突变体aca8水培苗的表型试验：

为了比较Col-0和aca8对干旱的敏感性，还使用PEG处理模拟干旱条件，观察Col-0和aca8水培苗的耐干旱的能力，分别将Col-0和aca8的水培苗置于不同浓度的PEG水培液中(浓度分别为0％，2％，5％和8％)，模拟不同程度的干旱情况。如图5B所示，4天后观察到aca8植株比Col-0生长的更好，更耐干旱胁迫。

实施例5：

突变体aca8对ABA的敏感性：

脱落酸ABA通常被认为是一种生长抑制型植物激素，例如抑制种子萌发、抑制生长促进休眠等。其中种子萌发抑制实验是一种非常有用的方法，可直观的展示出各种基因突变体对ABA敏感性的不同，从而证明基因功能是否与激素ABA的作用有关联。为了比较Col-0和aca8对ABA的敏感性差异，将Col-0和aca8的种子播在包含不同ABA浓度(分别为0μM，0.25μM，0.5μM，1μM，3μM和5μM)的MS培养基上萌发。萌发7天后可看出明显的差异，如图6所示，当ABA浓度等于或高于0.25μM时，Col-0和aca8相比，aca8植株对ABA较敏感，其种子萌发和根的伸长都受到严重抑制，由此看出，在种子萌发阶段At-ACA8基因的表达与ABA信号相关。

实施例6：

突变体aca8对蔗糖浓度变化的敏感性：

无菌苗培养是植物生理实验中常见的一种提供植物材料的方式，所使用的MS培养基中主要依靠蔗糖提供植物种子萌发和生长初期需要的碳源，较普遍的蔗糖使用浓度为1％-1.5％。但是本发明发现，突变体aca8的种子萌发和初期生长对蔗糖浓度的变化比较敏感。

将Col-0和aca8的种子播在包含不同蔗糖浓度(分别为0％，0.5％，1％，5％和7％)的MS培养基上萌发，当蔗糖浓度为0％时，aca8的种子萌发和生长受到严重抑制，当加入蔗糖后就能恢复与Col-0同样的萌发和生长模式，但是当蔗糖浓度高于5％时，aca8植株的生长就会受到一定抑制，蔗糖浓度为7％时抑制效果更加显著，如图7所示。因此，与野生型相比，蔗糖是保证aca8正常萌发的关键成分，aca8对蔗糖浓度的变化较敏感，尤其在高浓度蔗糖条件下还会影响植株的生长发育。

At-ACA8参与低温、高温、渗透胁迫等植物抗逆反应过程，突变株aca8对以上几种胁迫的抵抗能力强于野生型植株。

突变株aca8对培养基中有无蔗糖的施加，以及蔗糖浓度的升高较敏感，不施加蔗糖的情况下会严重抑制aca8种子萌发，生长阶段较易感知蔗糖浓度的升高而导致生长发育受抑制；突变株aca8在种子萌发阶段还对激素脱落酸(ABA)有响应，外源施加微量的ABA会显著抑制种子萌发，属于ABA敏感型突变株。

拟南芥Ca²⁺-ATP酶基因At-ACA8的相关生理实验证明，该基因参与植物生长发育调节和胁迫应答等过程，本发明对深入理解钙离子信号转导系统在调控植物生长发育和胁迫应答方面有实质性的价值；由于aca8突变体对低温、高温、渗透胁迫具有显著的抵抗力，并且以往的大量研究证明以拟南芥为材料所鉴定的大多数功能基因都能应用到其它植物的研究中，因此本发明还为植物品种的改良提供了一个优质基因，阐述了一种新的提高植物抵抗逆境能力并培育具有优良抗性品种的方法和机制，具有重要的经济意义和运用前景。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的其中几个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多改进。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的改进，均应认为是本发明的保护范围。