可时序控释双组分药物磷酸钙骨水泥的研究

摘要

磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cements，CPC)具有良好的生物相容性和生物活性，已经成功应用于临床。同时CPC的制备过程避免了高温烧结，是各类药物的优良载体材料。目前广泛研究的是载单组分药物CPC。但是，临床许多骨缺损与疾病(骨肿瘤、慢性骨髓炎等)有关，骨缺损修复是一个非常复杂的过程，需要阶段性给予药物以实现：植入前期，预防骨科围手术期的疼痛和感染；其次，长期供给药物促进骨组织的生长或治疗各类骨缺损伴随的疾病；因此载单组分药物CPC无法满足临床上对于不同药物的阶段性需求。此外，由于CPC中仅有固化时所形成的数微米的孔隙，不足以为新生组织的长入提供足够的空间，限制新骨长入的深度和速度，难以修复临床上常遇的大体积或病理情况下的骨缺损，因此，需要CPC载药的同时具备较大的微孔孔隙，为新骨长入提供空间。
　　因此，本论文的目的是制备药物释放时序可控的载双组分药物CPC，采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(dl-lactic-co-glycolic acid)，PLGA)微球包裹的丹酚酸B(Salbianicacid B，Sal B)与硫酸庆大霉素(gentamicin sulfate，GS)粉末载入到CPC中，通过GS的快速释放和微球中Sal B的缓慢释放实现时序性的药物释放，另外，PLGA载药微球的缓慢降解将提供大量的微孔。使得CPC植入后能够阶段性提供骨修复所需的药物，同时为新骨的长入提供较大的微孔孔隙。
　　本论文采用复乳法制备载丹酚酸B的PLGA(Mn：30.0 kg/mol)微球。选取外水相浓度、内水相浓度、外水相中氯化钠的量以及初乳中载入司班的量等因素，利用正交实验分析优化了PLGA微球的制备。通过调控外水相浓度和搅拌速度制备了四种不同粒径的PLGA微球。通过激光粒度仪、扫描电镜(SEM)、紫外可见光谱(UV-vis)等对微球粒度、形态以及药物释放性能等进行了分析。在此基础上，以Biocement D磷酸钙骨水泥为载体，以促进骨组织生长药物Sal B和GS为药物模型，将实验分为三组，第1组为载硫酸庆大霉素的CPC，载药量分别为0.5wt.％，1.0wt.％和1.5wt.％；第2组为载Sal B微球(MS)的CPC，载药量分别为5.0wt.％，10.0wt.％和15.0wt.％；第3组为载GS和MS的CPC，其中GS：0.5wt.％，1.0wt.％和1.5wt.，MS：5.0wt.％，10.0wt.％和15.0wt.％。以磷酸缓冲液(PBS)为液相，液固比为0.30 ml/g，制备了载药CPC和空白CPC，并通过Gillmore双针法、X-射线衍射(XRD)、紫外可见光谱(UV-vis)、扫描电镜(SEM)，以及力学性能实验机等对载药CPC的凝固时间、释药行为、微球降解空隙、孔隙率以及抗压强度等进行检测。此外，采用成骨细胞(MC3T3-E1)共培养法研究了CPC上细胞的粘附行为、增殖以及分化能力；琼脂培养板扩散实验中采用表皮葡萄球菌(ATCC，12228)对CPC样品进行了抗菌性检测研究。
　　正交分析表明：对于微球包封率影响的大小顺序为：外水相浓度＞内水相浓度＞氯化钠量＞司班量；内水相浓度、外水相浓度、氯化钠量和司班量之间共同作用会对结果产生更显著的影响。激光粒度结果显示微球的粒径分布图呈现单峰形态，表明微球的粒径分布较窄。SEM显示微球呈现光滑的球形，载药量随着粒径的增加而增加。微球药物释放表明：药物存在突释和缓释两个阶段，释放时间随着微球粒径的增加而延长。
　　Gillmore双针法测试和力学强度测试结果显示：与空白CPC相比，载双组分药物CPC的凝固时间都有显著性的延长；随着药物和微球载入量的增加，载双组分药物CPC力学强度显著性增加。药物释放结果表明：载单组分和双组分药物的CPC中的药物释放包括药物突释和药物缓慢释放阶段，药物释放量随着载药量的增加而增大，载双组分药物CPC实现了药物的时序性释放：其中所有的GS释放都符合Higuchi药物扩散释放模型，释放集中在第一周，达到了快速释放的效果；所有的Sal B的释放都复合零级释放模型，释放持续时间至少长达60天以上。另外，载双组分药物CPC中的两种药物的释放总体上都比对应的载单组分药物CPC中的药物释放速度要快、药物释放持续时间要短。
　　药物释放100天后，XRD检测结果显示，只有CPC-GS浸泡后有少量α-TCP，其它CPC基本都已转化为HA。GS吸附在α-TCP等固相成分的活性位点，抑制α-TCP等成分向HA转化，CPC-MS中，残留的α-TCP的衍射峰随着GS载入量的增加而增高。GS、PLGA的降解产物以及Sal B对HA晶体的成核生长都有抑制作用，当载入GS和MS的量分别超过1.0wt.％、10.0wt.％时，载药CPC的结晶度相对于空白CPC的结晶度都显著性下降了。SEM结果表明，载微球的两组CPC中出现了贯通的球形孔隙，而CPC-GS和空白CPC断面处分布有大量针状的羟基磷灰石晶体。孔隙率的计算结果表明：载药CPC的孔隙率均高于空白CPC的孔隙率，并且总体孔隙率和微孔孔隙率均随GS或MS载入量的增加而增大。除了CPC-GS组的总体孔隙率没有显著性差异外，CPC-MS和CPC-GS-MS两组样品的总体孔隙率和微孔孔隙率都有显著性增加。
　　成骨细胞与制备的各组CPC共培养一天后，活细胞绿色荧光染色显示：载药CPC和空白CPC样品表面都能粘附大量的活细胞，粘附样品表面的骨细胞均呈现多边形、具有强烈的立体感，并形成大量的细胞连接。另外，SEM电镜结果显示，成骨细胞长出了较长的伪足，并且细胞周围伸出大量微小的伪足，与基体紧密贴附，呈现良好的细胞活性，表明各组CPC均具有良好的生物相容性。
　　Almar Blue和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)检测结果表明：药物对共培养成骨细胞的影响呈现剂量和时间的依赖关系；细胞增殖活性和ALP活性的增强主要来源于长期释放的Sal B的作用，而ALP活性的下降主要是由于GS的释放。另外，GS表现出了很强的抗菌能力，同时Sal B也呈现出了一定程度的抗菌性能，双组分药物的联合释放不仅没有影响彼此的性能，还通过药物的联合作用增强了整体的抗菌性能。
　　本论文结果显示，直接在CPC粉末中共混载入GS和微球包裹的Sal B可以实现药物的程序性释放，GS释放集中在第一周且符合Higuchi药物扩散释放模型，Sal B达60天以上的释放且符合零级释放模型。并且，通过微球的降解可以提供大量的微孔孔隙，为新骨的生长提供空间。药物的联合释放对共培养成骨细胞的影响呈现剂量和时间的依赖关系。另外，药物的联合释放没有影响彼此的性能，而是通过药物的联合作用增强了整体的抗菌性能。