基于锌指文库的Ni2+等金属离子组合肽筛选与微生物作用研究

摘要

社会经济的快速发展，一方面极大地提高了人们的物质生活水平，同时也给我们的生存环境带来了重大的压力与挑战，因重金属污染带来的环境事故与危害，也已引起社会的高度关注和重视。微生物修复技术，作为环境重金属治理的一种重要途径，近年来得到广泛地研究与进展，而基因工程改造的微生物(GMO)是微生物修复技术的主要发展方向。其中的难点和要点是获得高亲和力的重金属结合肽（结合分子）以及筛选和获得高富集及耐受能力的环境微生物。锌指蛋白作为生物体内存在的重要转录因子，一方面参与了胞内DNA转录相关的多种生理生化过程，同时也为Zn2+、Ni2+等重金属结合肽的获得提供了重要的生物来源。而重金属矿区同时也为重金属富集及耐受微生物菌株的获得提供了天然了菌种资源库。
　　 本研究是基于实验室在前期工作中已经构建好的C2H2型锌指蛋白为基本骨架构建的细菌限制性肽库，利用Percoll密度梯度离心分离和筛选Zn2+、Ni2+重金属结合肽并测定其序列，然后利用生物信息学软件对测得的序列进行多重序列比对，进一步确定Zn2+、Ni2+的高亲和力结合肽的序列特征;再通过亲和力反筛测定以及重金属吸附含量测定等方法进一步确认筛选得到的重金属结合多肽对Zn2+、Ni2+的高效或专一性结合特性。然后在以上工作的基础上，再分别对Zn2+和Ni2+的金属结合肽序列进行氨基酸成分分析，以找到这些金属结合肽所共有的性质和规律。同时我们从镍矿尾矿中分离筛选得到Ni高耐受菌株，并利用相关的分子生物学技术—16SrDNA鉴定方法结合其生理生化特性对得到的菌株进行菌种鉴定。C2H2型锌指蛋白细菌限制型随机肽库的筛选的目的是期望能从中获得Ni等高亲和力结合肽，而从矿区土壤中筛选耐Ni微生物是为进一步工程菌的改造和重金属修复提供基础。
　　 主要研究结果:
　　 1.从实验室前期工作中已构建好的C2H2型锌指蛋白细菌限制性肽库中筛选得到了19条Zn2+和Ni2+结合肽。
　　 2.经4轮筛选得到的Zn2+结合肽以及Ni2+结合肽与金属离子的结合能力随筛选轮数递增而增加，P/N值分别可高达94.6和141.0。通过PAGE电泳测得融合蛋白的大小约为75KD。对P/N值较大的(P/N＞10)展示菌进行重金属吸附测定，发现展示菌6#和16#对重金属Ni的吸附能力较好，吸附率均可以达到50％左右，展示菌5#，17#对重金属的吸附效果未能达到理想的效果。
　　 3.经过对Zn2+和Ni2+结合肽序列进行生物信息学分析后发现具有以下共有序列特征:-H-X4-H-、-F-X-F-。其中氨基酸Ala、Thr、Trp、Val、Ser、Ile含量较高。
　　 4.从镍矿尾矿中筛选得到4株Ni2+耐受菌，在固体培养基中Ni2+耐受能力为550mg/L，在液体培养基中耐Ni2+浓度为300mg/L以上。经过鉴定得出它们分别为:芽孢杆菌，鞘氨醇杆菌，门多萨假单胞菌和施氏假单胞菌。门多萨假单胞菌Ni平均吸附率达23％。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 课题的研究背景和目的

1．1．1 课题研究背景

1．1．2 课题研究目的

1．2 课题的研究内容和意义

1．2．1 课题研究内容

1．2．2 课题研究意义

1．3 论文主要内容和组织

第2章 基于锌指骨架的细菌限制性随机肽库的重金属结合肽筛选

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．3 实验方法

2．3．1 锌指骨架细菌限制性随机肽库的Zn2+和Ni2+筛选

2．3．2 目的蛋白表达PAGE电泳测定

2．3．3 随机肽库的重金属结合肽序列测定

2．3．4 锌指随机肽库筛选菌重金属Ni2+吸附测定

2．4 实验结果与分析

2．4．1 细菌限制性随机肽库的重金属Zn2+和Ni2+结合肽树脂筛选

2．4．2 目的蛋白展示PAGE电泳测定

2．4．3 重金属结合肽序列测定

2．4．4 随机肽库的重金属结合肽对重金属Ni2+吸附性测定

2．5 讨论

2．6 小结

第3章 重金属高效结合肽序列生物信息分析

3．1 引言

3．2 主要软件及介绍

3．2．1 Clustalx(1．81)多序列比对

3．2．2 MEME软件及介绍

3．2．3 BioEdit软件及介绍

3．3 生物信息学分析结果

3．3．1 多重序列比对结果

3．3．2 MEME软件寻找模体序列

3．3．3 BioEdit软件分析结果

3．4 小结

第4章 重金属Ni2+耐受菌的筛选及鉴定

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 主要仪器

4．2．2 主要试剂

4．2．3 主要试剂配制

4．3 实验方法

4．3．1 筛选Ni2+高耐受菌株

4．3．2 测定高耐受菌株对Ni2+的吸附能力

4．3．3 采用16S rDNA法鉴定Ni2+高耐受富集菌株

4．3．4 高耐受菌株生理生化鉴定

4．4 实验结果与分析

4．4．1 Ni2+高耐受菌株的筛选

4．4．2 Ni2+高耐受菌株对Ni的吸附能力的测定

4．4．3 Ni2+高耐受富集菌株的分子生物学鉴定

4．4．4 高耐受菌株生理生化鉴定结果

4．5 小结

总结

综述

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文