黄鳍鲷骨骼肌中肌联蛋白和伴肌动蛋白的纯化及抗体制备

摘要

肌联蛋白(Titin)和伴肌动蛋白(Nebulin)是两种分子量分别为3000 kDa和1600—900 kDa的大分子量肌原纤维结构蛋白。由于这两种大分子量蛋白独特的结构特征以及在肌原纤维中的位置，最新研究认为它们可能在肌肉弹性的形成中起重要作用。本研究以海水鱼黄鳍鲷(sparus latus)为研究对象，旨在分离纯化Titin和Nebulin，制备特异性多克隆抗体，并研究这两种蛋白在不同贮藏条件下的自身降解及其酶解作用，为进一步研究水产动物大分子量肌肉结构蛋白的生物化学和食品学性质奠定基础。 用Sephacryl S-400凝胶过滤柱层析和电洗脱等方法对海水黄鳍鲷骨骼肌中的Titin和Nebulin进行分离纯化，并结合免疫印迹法进一步确认Titin。结果显示：从黄鳍鲷肌肉中分离纯化了高纯度的Titin，并与小鼠抗鸡Titin单克隆抗体发生明显的免疫交叉反应；通过电洗脱法纯化得到了电泳纯度的Nebulin。 以提纯的Titin和Nebulin为抗原分别免疫大鼠和新西兰家兔，制备大鼠抗黄鳍鲷Titin多克隆抗体和兔抗黄鳍鲷Nebulin多克隆抗体。结果显示：对大鼠抗黄鳍鲷Titin多克隆抗体，ELISA法检测效价约为1×10<'5>，免疫斑点印迹法检测效价至少为5×10<'4>；Western—blot检测大鼠抗黄鳍鲷Titin多克隆抗体与肌原纤维蛋白中的Titin发生特异反应，而与其他蛋白无免疫交叉反应。对兔抗黄鳍鲷Nebulin多克隆抗体，免疫斑点印迹法检测效价至少为5×10<'4>；Western—blot检测兔抗黄鳍鲷Nebtllin多克隆抗体与肌原纤维蛋白中的Nebulin能发生特异性反应，而与其他蛋白仅有微弱免疫交叉反应。 通过对在4℃和18℃下放置不同天数的黄鳍鲷肌肉、表皮色泽、眼睛清澈度、气味等感官鲜度指标观察并结合SDS-PAGE分析，探明Titin和Nebulin在贮藏过程中的分解变化。结果显示：4℃贮藏条件下黄鳍鲷肌肉的软化、腐臭等感官鲜度指标下降较慢；而18℃贮藏条件下则明显较快；SDS—PAGE显示4℃下即使冷藏11天Titin变化不显著，11天后逐渐发生降解。第7天Nebulin开始发生降解。但在18℃贮藏1天Titin和Nebulin即开始降解，第5天几乎检测不到Nebulin，第7天检测不到Titin，可见肌肉结构蛋白Nebuhn比Titin更易降解，但鱼体死后肌肉弹性的下降与这两种大分子量蛋白降解之间关联性不是很密切。 以肌原纤维和纯化蛋白为对象，研究在55℃、20℃和4℃下肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibrill-bound serine proteinase，MBSP)对Titin和Nebulin的分解作用。结果表明：55℃下MBSP对Titin和Nebulin有明显的分解作用且对Nebulin的分解强于Titin。而在20℃和4℃这样较低温度下，MBSP对Titin和Nebulin也有轻微的分解作用。 本研究首次从鱼体肌肉中纯化得到了Titin和Nebulin这两种大分子量蛋白，并制备得到了这两种蛋白高滴度、高特异性的多克隆抗体；并研究了MBSP对这两种蛋白的分解作用，弥补了国内外在该研究领域的空白，为鱼类肌原纤维大分子量结构蛋白新陈代谢的深入研究奠定了理论基础。

目录

文摘

英文文摘

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引言

第一章黄鳍鲷骨骼肌中Titin和Nebulin的分离纯化

1.1 Titin的分离纯化

1.1.1材料

1.1.2方法

1.1.3结果

1.2 Nebulin的分离纯化

1.2.1材料

1.2.2方法

1.2.3结果

1.3讨论

第二章Titin和Nebulin多克隆抗体制备

2.1大鼠抗黄鳍鲷Titin多克隆抗体的制备

2.1.1材料

2.1.2方法

2.1.3结果

2.2兔抗黄鳍鲷Nebulin多克隆抗体的制备

2.2.1材料

2.2.2方法

2.2.3结果

2.3讨论

第三章Titin和Nebulin的性质研究

3.1不同贮藏条件下Titin和Nebulin的分解变化

3.1.1材料

3.1.2方法

3.1.3结果

3.2不同温度下肌原纤维中Titin和Nebulin的自身降解与MBSP酶解作用的研究

3.2.1材料

3.2.2方法

3.2.3结果

3.3讨论

结语

参考文献

附录

致谢

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