α-乙酰乳酸脱羧酶产生菌的筛选及其基因的克隆和表达研究

摘要

双乙酰(diacetyl)是啤酒发酵中的不良风味物质，产生令人不愉快的反应，可以缩短啤酒熟化周期，提高生产效率，对啤酒工业来说极有经济价值。α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactatedecarboxylase，EC.4.1.1.5.简称为ALDC)能催化双乙酰的前体物α-乙酰乳酸(α-acetolactate)脱羧形成乙偶姻(acetoin)，避免双乙酰的生成。由于酵母菌不能产生ALDC，控制双乙酰含量的主要方法之-就是在啤酒发酵中添加ALDC制剂。 本研究开展了以下几方面的工作。首先，由乙酰乙酸乙酯甲基化制备α-乙酰氧基-α-甲基-乙酰乙酸乙酯，再经水解生成α-乙酰乳酸，作为测定α-乙酰乳酸脱羧酶活力的底物。其次，从土壤和水体中分筛选出7株具有较高酶活性的菌株，酶活最高的分类鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。再其次，利用PCR技术从枯草芽孢杆菌总DNA中克隆到0.77kb的DNA片段。测序结果表明该片段与报道的序列相比[65]，核苷酸序列同源性为98％、氨基酸序列同源性99.6％。将该片段插入到原核表达载体pBV220中，转化大肠杆菌DH5α(Escherichiacoli5α)，经热诱导后，SDS-PAGE分析表明ALDC基因实现了活性表达。最后，根据已知基因序列[31]，利用PCR方法从产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)中克隆到0.8kb的DNA片段。将该片段插入到原核表达载体pBV220中，转化大肠杆菌DH5α，经热诱导后，通过SDS-PAGE分析和酶活测定，表明ALDC基因获得了高效表达，重组细胞ALDC活力是出发菌株的1100倍。DH5α(pBVEDAD)在无选择压力下37℃连续培养60代，在42℃下热诱导5小时未见质粒丢失。本研究为开发利用α-乙酰乳酸脱羧酶奠定了坚实的基础。 第二章枯草芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆和表达 本章利用PCR技术从枯草芽孢杆菌总DNA中克隆到0.77kh的DNA片段。测序结果证明该片段为α-乙酰乳酸脱羧酶基因，与报道的来自枯草芽孢杆菌的α-乙酰乳酸脱羧酶基因序列相比，核苷酸序列同源性为98％、氨基酸序列同源性99.6％。将该片段插入到原核表达载体pBV220中，转化大肠杆菌DH5α(Escherichiacoli)，热诱导后，通过SDS-PAGE分析和酶活测定，结果表明ALDC基因实现了表达。 本章研究根据α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactatedecarboxylase，ALDC，EC.4.1.1.5)基因序列，利用PCR方法从产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)中克隆到0.8kb的DNA片段，经DNA序列分析表明该DNA片段为ALDC基因。将该片段插入到原核表达载体pBV220中，获得表达质粒pBVEDAD，转化大肠杆菌DH5α(Escherichiacoli)，经热诱导后，通过SDS-PAGE分析和酶活测定，结果表明ALDC获得了高效表达。重组细胞表达的ALDC酶活是出发菌产气肠杆菌(E.aerogenes)的1100倍。DH5α(pBVEDAD)在无选择压力下37℃连续培养60代，在42℃下热诱导5小时未见质粒丢失。

目录

四川师范大学学位论文独创性及使用授权声明

摘要

文献综述

第一章a-乙酰氧基-a-甲基乙酰乙酸乙酯的合成与a-乙酰乳酸脱羟酶产生菌的筛选

第二章枯草芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆和表达

第三章产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆和表达

全文小结

参考文献

读硕士期间发表文章情况

致谢