Amycolatopsis orientalisZEL-1的聚乙烯降解特性及其基于转录组测序的降解关键基因和代谢通路研究

摘要

为解决聚乙烯塑料在环境中难降解的问题，本研究筛选出一株菌用于聚乙烯塑料生物降解研究。经筛选纯化，对该菌进行生理生化实验和16SrDNA序列分析;将菌株先后接种于以不同分子量聚乙烯(PE)粉末(Mw=2000、5000、100000)和膜片(Mw＞100000)为唯一碳源的基础液体培养基中，28℃，180rpm培养;每24小时，用分光光度法测定菌体生长浓度和胞外蛋白含量;培养60天后，称取残留PE重量，用扫描电子显微镜观察膜片表观，用拉力测试机、水接触角测定仪以及红外光谱仪测定膜片性能。
　　为进一步提高原始菌株对高分子量PE的降解能力，本研究对原始菌株进行了诱变处理。采用紫外辐照、微波热效应、LiCl、盐酸羟胺、吖啶橙以及紫外+吖啶的方法对菌株进行诱变;用分子量2000、5000、100000再到膜片的PE分子量梯度筛选法，对诱变菌株进行筛选;通过诱变菌株在以聚乙烯为唯一碳源的培养基中的菌体生长情况、胞外蛋白含量、以及膜片失重率等指标，选出降解性能最优的菌株，再将该菌株与原始菌株在相同培养条件下（以PE膜片为唯一碳源）培养60天，测定膜片力学性能。
　　为找出降解PE的关键基因和代谢通路，我们将原始菌株在不同碳源培养条件下的（G组:以可溶性淀粉为唯一碳源;W组:以PE为唯一碳源）基因表达情况进行转录组测序分析，经RNA提取纯化、建库、测序、质控等过程，再进行GO、COG、KEGG数据库注释比对、聚类和富集分析;对两个处理组的基因表达量进行差异比较;最后随机选取差异基因进行RT-PCR表达量验证。
　　结果表明，筛选出的菌株为放线菌属的东方拟无枝酸菌（Amycolatopsis orientalis），命名为ZEL-1。该菌在分子量越低的聚乙烯培养液中，菌浓度、胞外蛋白含量、还原糖含量、聚乙烯失重率越高，菌液pH值下降得越快;电镜观察发现膜片表面有大量降解孔洞;膜片拉伸强度降低74.15％，断裂伸长率减少84.90％，力学性能显著下降;水接触角从78.58±0.10°变小到41.25±0.16°，亲水性增大;红外光谱研究结果表明，膜片在菌株的降解作用下先后生成酮羰基和酯羰基。
　　诱变育种结果表明，紫外辐照50s，微波诱变800Hz、120s，0.02％吖啶橙，0.7％LiCl，0.6％盐酸羟胺，为各方法的最优的诱变剂量。复合诱变采用紫外50s的突变菌株为出发菌株，再用0.02％吖啶橙诱变。PE培养基中菌体生长趋势，除盐酸羟胺组外，其他组均优于原始菌株组;紫外组胞外蛋白含量较原始组平均提高2.06倍，微波组平均提高1.24倍，吖啶组平均提高2.70倍，盐酸羟胺组平均提高1.60倍，复合诱变组平均提高3.30倍;盐酸羟胺组膜片失重率低于原始菌株组，其他组均高于原始菌株组，复合诱变组膜片失重率最大，高于原始组2.28倍;选择复合诱变组菌株UV-AO-1为优势菌株，PE降解60天后，UV-AO-1组水接触角比原始菌株组减小2.5°;拉伸强度减小3.37Mpa，断裂伸长率减少39.62％。
　　转录组测序结果表明，此次共得到12372(63.24％)个非冗余Unigene，其中2095条Unigene富集于代谢过程组中;与COG数据库比对，有3328条Unigene与COG数据库中的基因具有同源性;涉及到代谢活动相关的Unigene占50.57％;发现差异表达基因423个，与G组相比，W组有293个基因表达上调，130个基因下调;AlkB基因差异表达最为显著。与KEGG Pathway数据库比对，有5776条转录本比对到KEGG数据库中，有92个代谢通路出现差异;碳代谢、氨基酸合成、丙酮酸代谢途径的差异基因表达上调数量较多，乙酰-CoA合成、脂肪酸代谢的相关基因表达差异上调显著，柠檬酸循环的差异基因下调明显。
　　实时荧光定量PCR验证结果表明，荧光定量PCR得出的表达量与转录组测序结果的差异基因表达量上下调模式基本一致，证明此次转录组数据结果可信。
　　综上所述，本研究菌株ZEL-1能够直接降解普通的低、中、高分子量的PE塑料;诱变菌株UV-AO-1的降解性能优于原始菌株，具有更大的应用潜力。原始菌株在PE碳源的培养条件下，菌株代谢倾向于碳架构建，减少了糖类物质的合成和代谢;推测菌株ZEL-1对聚乙烯的降解始于Alk B基因编码的烷烃单加氧酶对聚乙烯的末端氧化断链作用，经由脂肪酸β氧化，完成PE的无机矿化。ZEL-1降解聚乙烯的基因表达差异，基本反映了不同碳源引起的代谢通路差异，为后期深入研究聚乙烯降解机理提供了理论依据。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 聚乙烯塑料污染的现状

1．2 废弃聚乙烯塑料的处理方法

1．2．1 目前聚乙烯塑料污染问题的解决办法

1．2．2 光降解途径

1．2．4 热裂解途径

1．2．3 微生物降解

1．3．1 聚乙烯的降解菌

1．3．2 聚乙烯塑料的降解条件、过程和机理

1．3．3 聚乙烯降解特性的研究方法

1．4 诱变育种概述

1．4．1 物理诱变方法及原理

1．4．2 化学诱变方法及原理

1．4．3 复合诱变方法及原理

1．4．4 生物诱变

1．5 转录组测序技术概述

1．5．1 转录组与转录组测序技术简介

1．5．2 转录组测序的研究方法

1．5．3 转录组测序在生物降解研究中的应用

1．6 本研究目的与技术路线

1．6．1 研究目的

1．6．2 研究意义和创新点

1．6．3 研究主要内容和技术路线

2 聚乙烯降解菌的筛选、鉴定及其降解特性研究

2．1 实验材料

2．1．1 菌种来源

2．1．2 培养基

2．1．3 仪器和药品

2．2 实验方法

2．2．1 菌株的分离纯化

2．2．2 菌株理化性质鉴定

2．2．3 16S rDNA鉴定

2．2．4 菌株ZEL-1降解效果研究——培养液组分研究

2．2．5 菌株ZEL-1降解效果研究——残留固体聚乙烯性能测定

2．2．6 数据处理

2．3．1 菌株理化性质鉴定

2．3．2 16S rDNA的扩增

2．3．3 菌株降解特性研究——培养液成分测定

2．3．4 菌株降解特性研究——残留固体PE性能测定

2．4 本章小结

3 Amycolatopsis orientalis ZEL-1的诱变育种

3．1 实验材料与仪器设备

3．1．1 菌株

3．1．2 实验药品和仪器

3．1．3 培养基

3．2 实验方法

3．2．1 出发菌株培养和菌悬液制备

3．2．2 紫外诱变

3．2．3 微波诱变

3．2．4 吖啶橙诱变

3．2．5 LiCl诱变

3．2．6 盐酸羟胺诱变

3．2．7 复合诱变

3．2．8 复筛

3．2．9 优势菌株降解性性能测定

3．3 结果与讨论

3．3．1 致死率和正突变率统计

3．3．2 复筛结果统计

3．3．3 优势菌株的筛选结果统计

3．3．4 优势菌株与原始菌株降解性能比较

3．4 本章小结

4 Amycolatopsis orientalis ZEL-1的转录组测序以及聚乙烯降解关键酶和主要代谢通路研究

4．1 实验材料

4．1．1 菌株

4．1．2 培养基

4．1．3 药品与耗材

4．1．4 仪器设备

4．2 实验方法

4．2．1 样品准备

4．2．2 转录组建库、上机流程

4．2．3 原始数据质量控制

4．2．4 与参考基因组比对以及GO功能、CGO分类、KEGG通路注释

4．2．5 基因表达量分析

4．2．6 不同碳源的G组和W组基因表达差异分析

4．2．7 荧光定量PCR验证转录组基因表达差异

4．3 结果与讨论

4．3．1 RNA提取质检结果

4．3．2 测序数据质量控制统计

4．3．3 与参考基因组序列比对结果统计

4．3．4 转录组整体质量评估

4．3．4 GO、COG、KEGG通路注释结果统计

4．3．6 基因表达量分析

4．3．7 不同碳源组的基因表达差异分析

4．3．8 菌株ZEL-1降解聚乙烯的关键基因和代谢通路分析

4．3．9 荧光定量PCR验证转录组基因表达差异结果

4．4 本章小结

5 总结与展望

参考文献

附录

致谢

在校期间的研究成果