转双价抗虫基因棉花的获得、检测和基因表达研究

摘要

本实验利用花粉管通道方法将苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫蛋白基因和雪花莲外源凝集素(gna)基因转化到棉花中，提高棉花对鳞翅目害虫的抗性和对桃蚜的耐性。 以棉花品系SN为材料，将pBSGS1M质粒转入受体大肠杆菌DH5 α中，扩增后提取质粒DNA，待棉花盛花期时，利用花粉管通道转化法将质粒DNA注射到授粉20h左右的子房中。将收获的种子浸泡萌发后植于温室，经过田间卡那霉素筛选，获得了12株转基因植株。PCR、Southern blotting检测结果表明，Bt和gna基因已经整合到棉花基因组中。对转化植株进行虫试的结果表明，受试植株上的棉铃虫在5d内的校正死亡率超过了80％，而且存活幼虫的生长发育受到明显的抑制；转化植株具有较强的抗蚜活性，平均能够抑制桃蚜60％以上的蚜口密度，最高的高达70％。结果表明，利用改造的抗虫基因转化棉花植株已获得既抗虫又耐蚜的转基因的棉花。 对转基因棉花的苗期倒3叶、苗期倒5叶、现蕾期功能叶、花期功能叶、根、茎皮、铃皮、铃内容物、花苞片、花瓣进行三明治ELISA检测，结果表明转基因植株均有不同程度的Bt杀虫蛋白表达。外源基因在植株各部位或不同的组织器官表达有显著的差异，其中在现蕾期功能叶达到2923.7ng/g鲜重。另外，外源基因的表达量存在时间和空间的不同分布。转化用的表达载体上添加了一个分泌信号肽编码序列，可使表达的Bt蛋白分泌到细胞外。利用本试验探索出的棉花细胞间隙液的提取方法提取细胞间隙液，通过ELISA检测，细胞间隙液中Bt蛋白的量为53.57ng/g鲜重，可以初步确定Bt蛋白分泌到了胞外，在此基础上进一步探索Bt表达蛋白在转基因棉花细胞中的定位。

目录

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论文中的缩写词

1文献综述

1.1棉花遗传转化技术研究

1.1.1农杆菌介导法

1.1.2花粉管通道法

1.1.3基因枪法

1.1.4选择标记基因

1.1.5报告基因

1.2遗传转化技术在棉花育种实践中的应用

1.2.1棉花抗虫育种

1.2.2棉花抗病育种

1.2.3棉花抗除草剂育种

1.2.4棉花纤维品质改良育种

1.3我国转基因棉花研究的现状及展望

1.3.1探索有效的基因转化方法

1.3.2提高棉花品质

1.3.3加强棉花基因组研究

1.4棉花叶片细胞间隙液的提取

1.5选题背景和立题依据

2材料与方法

2.1材料来源

2.2菌株和载体质粒

2.3实验方法

2.3.1质粒DNA的提取

2.3.2大肠杆菌(E.coli DH5 α)感受态细胞的制备

2.3.3 DNA对E.coli DH5 α的转化

2.3.4花粉管通道途径转化

2.3.5组织化学鉴定

2.3.6抗虫性鉴定

2.3.7抗虫基因的分子检测

2.3.8 ELISA检测

2.3.9细胞间隙液的提取和鉴定

3结果与分析

3.1花粉管通道法途径转化棉花

3.2卡那霉素田间组织化学鉴定

3.3转基因抗虫棉的分子检测

3.3.1转基因抗虫棉的Bt基因的PCR检测

3.3.2转基因抗虫棉的gna基因的PCR检测

3.3.3转基因抗虫棉的Bt基因Southernblotting

3.3.4转基因抗虫棉的gna基因Southernbotting

3.4转基因植株的抗虫性鉴定

3.4.1棉铃虫抗性检测

3.4.2蚜虫抗性鉴定

3.5转基因抗虫棉的ELISA检测

3.6转基因抗虫棉细胞间隙液的提取和鉴定

3.6.1细胞间隙液的鉴定

3.6.2转基因抗虫棉细胞间隙液ELISA检测

4讨论与结论

4.1花粉管通道法转化棉花

4.2棉花总DNA的提取

4.3转基因棉花Bt杀虫蛋白在各生育期不同组织器官的含量

4.4细胞间隙液的提取

4.5结论

参考文献

致谢

攻读学位期间参加科研项目和发表的学术论文