牛分枝杆菌的噬菌体检测方法建立及初步应用研究

摘要

目的：建立牛分枝杆菌的噬菌体检测技术，研究最佳检测条件；初步探讨该法在模拟乳样样品和203头奶牛临床乳样中检测牛分枝杆菌的应用价值。 方法：应用分枝杆菌噬菌体D29感染牛分枝杆菌，对噬菌体生物扩增法中各实验条件进行研究，比较各种检测条件对测定结果的影响，建立了噬菌体生物扩增法检测牛分枝杆菌；同时对主要试剂的稳定性进行研究，并将建立的方法用于牛分枝杆菌标准株、21株牛分枝杆菌临床分离株和20种常见非结核分枝杆菌的检测，同时对模拟乳样样品进行检测；此外对203头疑患牛结核病奶牛的乳样进行检测，并与皮内变态试验、涂片法、罗氏培养结果进行比较。 结果：噬菌体生物扩增法检测牛分枝杆菌最佳作用条件：10<'9>PFU/ml的分枝杆菌噬菌体，37℃感染2h可检出60～120 CFU/ml的牛分枝杆菌；杀毒剂浓度为100mmol/L，室温作用10min可完全灭活游离噬菌体；指示细胞浓度在4mg/ml时，形成的噬菌斑清晰可见，便于计数；加热灭活的细菌和指示细菌不被噬菌体感染。16种常见NTM参考菌株和6种其他细菌检测结果均为阴性；偶然、胞内、金色、草分枝杆菌在高浓度时(>10<'5>CFU/ml)为阳性，在低浓度时(<10'CFU/ml)检测结果为阴性；重复性试验表明，批内、批间变异系数均小于15％，重复性良好。对主要试剂的稳定性进行研究，结果表明，4％FAS在4℃保存40周后能将1.0×10<'9>PFU/ml的噬菌体完全杀灭；噬菌体在4℃液体保存28周后，效价下降不足10的一个数量级：4℃保存的耻垢分枝杆菌菌悬液40周后的活菌量由1.0×10％CFU/ml降至1.0×10<'9>CFU/ml，不影响PhaB法中的噬菌斑数量。将建立的方法对21株临床分离株直接检测以及加牛乳后进行检测：直接检测时结果均为阳性：模拟牛乳液样品中，4株检测结果较差，噬菌斑较少(噬菌斑在2～9个之间)，以10个噬菌斑为阳性结果，则检测结果均为阴性；其余的17株检测结果均为阳性。离心后检测结果均为阳性，较没有离心的检测结果好；203头奶牛进行检测，PhaB法、涂片法、皮内变态试验和罗氏培养结果分别有14头(6.9％)、17头(8.4％)、21头(10.3％)和12头(6.0％)为阳性，PhaB法与其他三种方法比较，阳性准确性、特异性都在96％以上，敏感性在71％～100％之间。 结论：对PhaB法测定牛分枝杆菌中各种检测条件的研究，建立了检测牛分枝杆菌的PhaB检测技术；将建立的方法用于牛分枝杆菌标准株、21株牛分枝杆菌临床分离株和20种常见非结核分枝杆菌的检测，获得了满意的检测结果：同时对PhaB中主要试剂的稳定性进行研究，确定了在4℃保存；将建立的方法用于模拟牛乳液样品中牛分枝杆菌的检测，获得满意的结果；模拟乳液离心后检测结果较没有离心的检测结果好；建立的PhaB法与涂片、皮内变态试验和罗氏培养结果比较，阳性准确性、特异性都在96％以上，敏感性在71％～100％之间，说明该法与常规检测牛分枝杆菌方法符合率高，特异性强，值得临床应用。

目录

论文说明：缩写词与中英文对照

声明

文献综述

实验研究

1材料与方法

1.1主要材料和试剂及其配制

1.2研究方法

2实验结果

2.1牛分枝杆菌最佳作用浓度

2.2噬菌体与牛分枝杆菌感染效率的关系

2.3噬菌体作用浓度和感染时间

2.4噬菌体最佳作用时间和浓度

2.5钙离子对噬菌体侵然能力的影响

2.6 FAS浓度和作用时间及温度

2.7指示细菌作用浓度

2.8 FAS对M.Bovis及指示细胞的影响

2.9琼脂工作条件

2.10平板培养时间

2.11 PhaB法检测M.Bovis的灵敏度

2.12特异性试验

2.13 PhaB法检测牛分枝杆菌的重复性试验

2.14主要试剂的稳定性

2.15临床分离株及模拟牛乳样品的检测

2.16 203头奶牛的细菌涂片、皮内变态试验、细菌培养以及其乳样的PhaB法检测结果

3分析与讨论

4结论

参考文献

附图

致谢

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