牛分枝杆菌检测方法的建立及应用研究

摘要

目的：建立一种结核分枝杆菌的双重PCR检测方法；探讨乳液在牛结核病检测中的应用价值；利用PCR方法和PhaB法以及细菌分离培养法，对模拟样本和临床样本进行检测，探讨各种方法的临床应用价值，为建立牛结核病快速诊断方法奠定基础。
　　 方法：以牛分枝杆菌标准菌株，建立一种PCR扩增方法；研究PhaB法检测模拟鼻拭子样本中牛分枝杆菌的灵敏度；利用模拟乳样建立乳样的PCR和PhaB检测方法；将PCR法、PhaB法和细菌分离培养法应用于临床样本的检测。
　　 结果：建立了一种分枝杆菌的双重PCR检测方法，NTM菌株扩增片段长度在361bp～383bp之间，MTC菌株扩增出两条目的带，长度分别为368bp和225bp，灵敏度为大于等于10-6mg/mL的菌含量，检测时间为5h。PhaB法检测模拟鼻拭子样本的灵敏度为牛分枝杆菌活菌含量为50～500条/mL，24h内可判读结果。模拟乳样检测可得阳性结果。对206份临床样本进行检测，结果PCR扩增阳性3份，均为PPD阳性样本；PhaB法检测结果全为阴性；从一份PCR和PPD同为阳性的样本中分离到一株分枝杆菌，菌型鉴定结果为结核分枝杆菌，对该分离株进行PhaB法和PCR法检测结果均为阳性。
　　 结论：所建立的双重PCR检测方法，特异性好，为结核分枝杆菌的快速检测提供了一可供选择的手段；相比之下，PhaB法检测所用时间较长，但可以直接检测样本中活菌的存在，结果更加可靠；乳液可用于牛结核病的诊断；应用于临床检测，PCR和PhaB法的灵敏度还有待进一步提高。

目录

文摘

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论文说明：缩写词与中英文对照

声明

第一章 引言

1.1牛结核病的研究概况

1.1.1牛结核病原学

1.1.2牛结核病的流行病学

1.1.3牛结核病的致病及发病机制

1.1.4牛结核病的危害

1.2牛结核病的诊断

1.2.1细菌学方法

1.2.2免疫学方法

1.2.3分子生物学方法

1.2.4噬菌体生物扩增法(PhaB法)

1.3实验目的与意义

第二章 结核分枝杆菌双重PCR检测方法的建立

2.1材料和方法

2.1.1 菌株来源

2.1.2细菌基因组DNA的制备

2.1.3 PCR扩增

2.1.4灵敏度试验

2.1.5对模拟鼻拭子样本中牛分枝杆菌的扩增

2.1.6对模拟乳样本中牛分枝杆菌的扩增

2.2结果

2.2.1 PCR扩增条件

2.2.2特异性试验

2.2.3灵敏度试验

2.2.4模拟样本中牛分枝杆菌的扩增检测

2.2.5测序结果

2.3分析与讨论

2.4.结论

第三章PhaB法对模拟样本中牛分枝杆菌的检测

3.1材料和试剂

3.1.1 受试菌株

3.1.2指示细胞及其制备

3.1.3指示平板的制备

3.1.4噬菌体增殖、效价测定及保存

3.1.5杀毒剂及其制备

3.1.6培养基及其它试剂

3.1.7主要仪器设备

3.2方法

3.2.1 PhaB法检测牛分枝杆菌的灵敏度试验

3.2.2模拟鼻拭子样本中牛分枝杆菌的PhaB法检测

3.2.3模拟乳样本中牛分枝杆菌的PhaB法检测

3.3结果

3.3.1 PhaB法检测牛分枝杆菌的灵敏度试验

3.3.2模拟鼻拭子样本的检测

3.3.3模拟乳样本的检测

3.4分析与讨论

3.5结论

第四章不同方法对临床样本中分枝杆菌的检测

4.1材料与方法

4.1.1临床样本来源

4.1.2样本的消化处理

4.1.3细菌分离培养

4.1.4细菌菌型鉴定

4.1.5 PhaB法检测

4.1.6 PCR法检测

4.2结果

4.2.1细菌分离培养

4.2.2 PhaB法检测

4.2.3 PCR法检测

4.3讨论与分析

4.4结论

参考文献

致 谢

作者简介

附 录