甘蓝型油菜napin基因启动子的克隆与几个重要农艺性状的初步QTL定位

摘要

油菜是一种重要的油料作物，在世界各地除非洲少数地区以外，几乎都有栽培。油菜经济价值的提高首先需要改良油菜栽培品种，而油菜新品种的改良主要体现在油菜品质和产量的改良两个方面。在油菜品质改良方面，利用基因工程手段来改变油菜种子的化学组成成分及其含量是改良油菜品质的一个有效措施，其中，基因工程手段的一个关键技术就是调节控制优良基因的表达，而高等植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作用。植物基因启动子是重要的顺式作用元件，是RNA聚合酶识别并与之结合，从而起始基因转录的一段DNA序列。因此，油菜组织特异性启动子的克隆和表达验证是一项重要工作。 在油菜产量改良方面，由于油菜产量及与产量有关的其它许多农艺性状均表现为微效多基因控制的数量遗传，研究这些数量性状位点(QTL)在油菜基因组染色体上的位置和对性状表现影响的程度，具有积极现实的意义。近年来，随着数量遗传学和现代生物技术的发展，借助DNA分子标记和QTL作图，复杂的数量性状可剖分为若干离散的孟德尔因子所决定的组分，进而确定其在染色体上的位置及其效应大小。同时，应用分子标记辅助选择(MAS)和转基因等技术，使油菜产量的进一步提高成为可能。 1．甘蓝型油菜napin基因启动子的克隆 Napin是一类由多基因编码的种子贮藏蛋白，广泛存在于芸苔属植物的种子里，占种子蛋白总量的20％～30％。Napin基因是在．ABA的影响下，以组织特异型方式表达。 本实验根据GenBank中已经公布的napA全序列5’端非编码区设计引物，以甘蓝型油菜中双4号基因组DNA为模板，通过PCR扩增，获得的扩增产物克隆到pMD18-T载体并测序。结果表明，所克隆的扩增序列长度为1159bp，经比较分析，该序列与napA相比，只是有几个核苷酸差异，与其它已公布的napin基因启动子同源性也很高。 该序列富含AT碱基，具有TATA-box、CAAT-box、G-box、GATA-box等高等植物启动子的序列特征。为了进一步验证其组织特异性表达功能，把它插入到pCAMBIA-1301载体，替代pCAMBIA-1301中GUS基因前的CaMV35S启动子，构建成GUS基因表达载体pCl301.N。把重组载体转化到农杆菌LBA4404中，感染ABA诱导的油菜种子，经GUS染色证明，该napin基因启动子具有种子特异性表达功能。 2.甘蓝型油菜几个重要农艺性状的初步QTL定位 利用杂交组合中g24号×H228 F<,1>，经8代自交，构建成RIL群体，在第8代时调查亲本和随机选择的142个RIL群体株系株高、一次有效分枝数、单株产量等11个农艺性状。RIL群体中11个农艺性状之间相关分析表明：单株产量与株高、一次有效分枝数、主花序长度、主花序有效角数、主花序角密度、角果长度、每角粒数、千粒重、单株有效角果总数呈极显著正相关。 选用SSR引物对中双4号和H228间进行多态性检测，有152对引物在双亲间表现多态性，用这些引物分别对142个株系进行检测，构建了含有123个SSR分子标记、18个连锁群的连锁遗传图，总图距为3483.1cM，标记间平均距离为28.32cM，各标记在18个连锁群上的分布很不均匀，其中，第1、12、13、17连锁群上分布标记较多，其它连锁群上分布标记较少。 根据RIL群体性状方差和SSR差异位点分析，该群体可以进行初步的遗传图谱构建和QTL定位，但各个性状的平均纯合度不太纯，还需进一步自交纯合，本次所获得遗传图谱和QTL位点将有一定误差。与Lowe等(2004)的遗传图谱比较，发现26个相同的标记位点，只占本实验标记位点的21.1％。 11个农艺性状共检测到81个数量性状位点(QTLs)。其中，株高检测到4个QTLs解释性状表型变异的10.3％～28.9％；一次有效分枝数检测到2个QTLs解释性状表型变异的22.1％和47％；有效分枝部位检测到16个QTLs，解释性状表型变异的12.2％～51.8％；主花序长度检测到15个QTLs, 解释性状表型变异的7.4％～26.6％；主花序有效角数检测到5个QTLs,解释性状表型变异的11.2％～25％；主花序角密度检测到1个QTLs,解释性状表型变异的17.3％；角果长度检测到12个QTLs,解释性状表型变异的24％～36.7％；每角粒数检测到2个QTLs,解释性状表型变异的9.6％和16.9％；千粒重检测到2个QTLs,解释性状表型变异的26％和13.7％；单株有效角果总数检测到11个QTLs,解释性状表型变异的14.8％～47.2％；单株产量检测到11个QTLs,解释性状表型变异的1 4.3％～32.8％。 此外，还对GUS表达、启动子效率、遗传图距及影响因素、QTL定位的精确度等进行了讨论。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分甘蓝型油菜napin基因启动子的克隆

1文献综述

1.1高等植物基因启动子的结构特征

1.2植物启动子的类型

1.3克隆植物启动子的方法

1.4甘蓝型油菜基因克隆研究进展

1.5本研究目的意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.2重要试剂及溶液

2.3重要仪器设备

2.4培养基

2.5实验方法

3结果与分析

3.1油菜种子napin基因特异表达启动子的克隆

3.2 napin基因特异表达启动子的分析

3.3植物表达载体Pc1301.N的构建与检测

3.4GUS基因瞬时表达检测

4讨论

第二部分甘蓝型油菜几个重要农艺性状的初步QTL定位

1文献综述

1.1油菜重要性状的分子标记及其QTL研究进展

1.2 QTL定位的常用作图群体

1.3 QTL定位常用的分子标记

1.4 QTL定位方法的发展

1.5 QTL定位的主要应用

1.6本研究的目的意义

2材料与方法

2.1 RIL群体构建

2.2田间试验设计与管理

2.3性状考察

2.4 SSR引物来源

2.5 SSR分析

2.6 SSR资料的收集及统计分析

2.7遗传图谱的绘制和QTL定位

3结果与分析

3.1重组自交系(RIL)群体的构建及性状表现

3.2 SSR分子标记检测

3.3 RIL群体评价

3.4 SSR遗传图谱的构建

3.5农艺性状的QTL定位

3.6相关农艺性状间的QTL分析

4讨论

4.1遗传图距及影响因素

4.2 影响QTL定位精确度的因素

4.3分子遗传图谱整合及染色体定位

4.4后续研究设想

参考文献

致谢

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