甘蓝型油菜重要农艺性状的QTL定位以及相关基因的克隆

摘要

甘蓝型油菜是世界上继大豆之后的第二大油料作物，不仅是我国食用油的主要来源，也是天然优质饲料蛋白的重要来源。因此高产和优质一直是油菜研究和育种的两大首要目标。然而作物的产量性状和品质性状都是非常复杂的数量性状，它们是作物整个生长周期内一系列生长发育过程的最终表现形式，是整个生育期内若干性状综合作用的产物，其复杂性限制了对它们遗传结构的研究。虽然目前我国油菜的单产已经得到大幅度提高，并且选育并推广种植了一系列双低油菜品种。然而，我国人口的持续增加加剧了我国食用油的供需矛盾，人们对食用油品质的要求也随着生活水平提高而日趋严格。因此进一步提高油菜产量和改良油菜品质仍然迫在眉睫，而在遗传上揭示油菜产量性状和品质性状的直接或间接决定因子，解析产量和品质性状的遗传基础是实现这一目标的关键步骤。
　　本研究将德国冬性甘蓝型油菜品种Express和中国半冬性甘蓝型油菜品系SWU07杂交F1代小孢子培养得到的包含261个株系的DH群体在德国冬性生态环境和中国半冬性生态环境（包括不同年份环境）种植，以及由这些DH株系两两随机杂交衍生得到的包含233个株系的重构F2群体在中国半冬性环境（包括不同年份环境）中种植，调查了甘蓝型油菜11个产量和产量相关性状（开花期、角果长度、角果宽度、角果表面积、千粒重、每果粒数、主花序长度、株高、分枝高度、分枝数目和小区产量）以及6个品质性状（种子硫苷含量、蛋白质含量、含油量、油酸含量、亚油酸含量和亚麻酸含量）的表型变异。结合由SSR分子标记构建的DH群体遗传连锁图谱和各性状的表型数据进行了甘蓝型油菜一系列重要农艺性状的QTL定位与分析。针对目的性状（角果性状和千粒重，以及种子硫苷含量），结合了QTL区域微共线性分析、QTL区域精细定位、全基因组关联分析、基因克隆、序列比对和功能标记等多种研究途径，以期揭示性状的遗传基础。本文的研究成果主要包括以下几个方面:
　　1.利用DH群体构建包含SSR分子标记的甘蓝型油菜遗传连锁图谱
　　利用487个SSR分子标记在DH群体261个株系中的基因型，通过JoinMap3.0软件构建了一张包含316个SSR分子标记的遗传连锁图谱。图谱覆盖甘蓝型油菜的19条连锁群，图谱含有316个SSR分子标记，其中包括文献已报道的公共SSR标记166个和自主设计的SSR标记150个，图谱总长为1198.37 cM，标记间的平均遗传距离为3.77 cM。其中分布于A基因上的标记数目为224，分布于C基因上的标记数目为92。
　　2.利用DH群体和重构F2群体对11个产量以及产量相关性状进行QTL检测
　　11个产量以及产量相关性状在两个群体和各个环境中总共检测到208个QTL，分布于除A10、C02和C07的甘蓝型油菜的16条连锁群。将每个性状在不同生态环境或者不同年份环境或者不同群体中重复检测到的QTL进行整合(consensus-QTL)，最终得到133个与这11个产量以及产量相关性状相关的consensus-QTL位点。其中包括开花期的20个位点，角果长度的11个位点，角果宽度的8个位点，角果表面积的8个位点，千粒重的12个位点，每果粒数的7个位点，主花序长度的17个位点，植株高度的11个位点，分枝高度的10个位点，分枝数目的6个位点，以及小区产量的24个位点。小区产量的24个cosensus-QTL位点中，有16个位点能与本研究中考察的其它10个产量相关性状的QTL置信区间相互重叠，暗示了产量性状较为复杂的遗传基础。所有133个consensus-QTL位点中，81.82％的consensus-QTL只在单一生态环境中出现，82.71％的consensus-QTL只在单一群体中出现，76.69％的consensus-QTL只在单一年份环境中出现，说明了生态环境和群体类型相比年份环境更能够影响QTL的稳定表达。尽管如此，绝大部分consensus-QTL只在单一环境、单一年份和单一群体中出现，这说明大部分产量以及产量相关性状QTL的表达都依赖于环境条件或者群体类型。
　　3.A09连锁群角果性状与千粒重主效QTL簇与C08连锁群角果性状QTL的同源性分析以及精细定位
　　在A09连锁群上检测到一个富集角果长度、角果表面积和千粒重主效QTL的QTL簇，单个QTL最高可以揭示24.10％～37.39％、16.74％～27.81％和15.69％～30.2％的角果长度、角果表面积和千粒重的表型变异。利用已发表的白菜A09和甘蓝C08为参考基因组进行QTL区间的微共线性分析，发现A09上富集角果性状和千粒重的QTL簇与C08上角果性状的QTL被共定位到了白菜A09和甘蓝C08参考基因组的相同位置，明确了A09和C08连锁群角果性状和千粒重QTL区间的同源性关系。选取DH群体中具有极端大角果大籽粒和极端小角果小籽粒的株系组成两个极端表型的群体，利用覆盖全基因组的SNP标记将影响角果长度和千粒重的位点锚定到了白菜A09基因组上，不仅与初步定位的角果长度和千粒重的QTL区间相同，并且将初步定位的QTL置信区间缩小到A09基因组上仅1.18 Mb的范围，为QTL的精细定位，快速有效的克隆候选基因提供了捷径。
　　4.利用DH群体和重构F2群体对6个品质性状进行QTL检测与分析
　　甘蓝型油菜种子硫苷含量、蛋白质含量、含油量、油酸含量、亚油酸含量和亚麻酸含量这6个品质性状在两个群体和各个环境中总共检测到198个QTL，分布于除A08、A10和C04的甘蓝型油菜的16条连锁群上。将每个性状在不同生态环境或者不同年份环境或者不同群体中重复检测到的QTL进行整合(consensus-QTL)，最终得到116个与这6个品质性状相关的consensus-QTL位点，其中包括种子硫苷含量的20个位点，蛋白质含量的20个位点，含油量的21个位点，油酸含量的22个位点，亚油酸含量的13个位点，以及亚麻酸含量的19个位点。116个consensus-QTL位点中，80.95％的位点只在单一生态环境中出现，87.07％的位点只在单一群体中出现，70.69％的位点只在单一年份环境中出现，说明了群体类型对这6个品质性状QTL检测的影响程度最大，其次是生态环境对QTL的影响，而QTL对年份环境的依赖程度相对群体类型和生态环境来说最弱。
　　5.种子硫苷含量QTL区间的候选基因预测、基因序列分析以及功能标记开发
　　本研究利用白菜基因组信息和拟南芥中报道出的与硫苷代谢相关的基因，通过甘蓝型油菜QTL与白菜和甘蓝参考基因组间的微共线性分析，在QTL区间鉴定了19个硫苷候选基因，并通过GB-SSR标记、基因序列分析以及CAPS功能标记共同确定了影响本研究分离群体种子硫苷含量表型变异的候选基因，BnAPR3和BnIMPDH1。代表BnAPR3和BnIMPDH1基因序列变异的CAPS功能标记所在QTL区间分别揭示4.89％～6.51％和4.70％～8.68％的种子硫苷含量表型变异。
　　通过全基因组关联分析与传统QTL定位相结合的方法，在A02基因组上共定位了对种子硫苷含量有显著贡献的区域。该区域不仅在分离群体中定位到了种子硫苷含量主效QTL，也在关联群体中检测到显著的SNP位点。其中距离显著SNP距离最近的候选基因为BnMYB28。通过对位于共定位区间内的候选基因BnMYB28在两个亲本中基因序列的比较，发现BnMYB28在半冬性亲本SWU07中的扩增片段大小为1564 bp，而冬性亲本Express的BnMYB28基因序列在距离基因起始密码子+1279 bp的基因编码区位置存在24 bp的碱基缺失，扩增出的基因片段为1540bp，两个亲本在BnMYB28基因的编码序列上相差24 bp。
　　6.由环境因素调控种子硫苷含量的位点检测
　　为了挖掘出由外界环境调控甘蓝型油菜种子硫苷含量的位点，我们在DH群体中开展了德国和中国两大环境QTL的比较研究。DH群体总共检测到的60个种子硫苷含量QTL中，37个QTL和23个QTL分别在中国和德国环境中被检测到。尽管83.05％的QTL(49个QTL)能够在两个环境中同时表达，但是位于A02、A04和A09连锁群的三个种子硫苷含量主效QTL簇在德国和中国环境下QTL的贡献率表现出极显著水平的差异(P＜0.01)。同时，通过种子硫苷含量QTL、开花期QTL，以及利用两个大环境中种子硫苷含量均值之差来代表油菜对不同生态环境的差异响应，进行这三个性状的QTL共定位比较，发现A02、A04和A09连锁群上表现环境间QTL效应显著差异的硫苷QTL簇，与开花期或种子硫苷环境差异响应性状的QTL置信区间重叠。综合种子硫苷含量与开花期性状的极显著正相关，说明了A02、A04和A09连锁群上这三个遗传区域内的种子硫苷主效QTL对种子硫苷含量的影响可能与外界环境的调控相关，这将为揭示由环境因素调控种子硫苷含量的位点提供重要的参考。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 植物数量性状的遗传研究

1．1．1 连锁作图统计方法

1．1．2 关联分析

1．1．3 关联分析与连锁分析的互补

1．1．4 高通量测序分子标记推动植物QTL定位的发展

1．1．5 植物QTL的克隆

1．2 产量和产量相关性状的遗传研究

1．2．1 农作物产量和产量相关性状研究概述

1．2．2 农作物产量以及产量相关性状基因的鉴定

1．2．3 甘蓝型油菜角果性状和千粒重两大产量相关性状的遗传研究

1．3 甘蓝型油菜品质性状的遗传研究

1．3．1 硫苷生物学研究

1．3．2 芸薹属硫苷的数量遗传学研究

1．3．3 甘蓝型油菜低硫苷育种现状

1．4 芸薹属比较基因组学研究

1．4．1 芸薹属和拟南芥基因组测序进展

1．4．2 芸薹属物种基因组间的比较研究

1．4．3 芸薹属物种微共线性研究

1．5 本研究的目的和意义

1．5．1 研究目的

1．5．2 研究意义

第2章 甘蓝型油菜产量及其相关性状的QTL定位和目标性状的基因克隆

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 试验材料

2．2．2 田间实验设计与性状考察

2．2．3 分离群体基因型检测

2．2．4 遗传连锁图谱的构建

2．2．5 数据统计分析

2．2．6 QTL的检测和分析

2．2．7 QTL的比较分析

2．2．8 QTL精细定位

2．3 结果与分析

2．3．1 甘蓝型油莱遗传连锁图谱的构建

2．3．2 产量和产量相关性状表型数据的统计分析

2．3．3 产量和产量相关性状的方差和遗传力分析

2．3．4 产量和产量相关性状之间的遗传相关分析

2．3．5 产量和产量相关性状QTL的检测和分析

2．3．6 产量和产量相关性状QTL对自然环境和群体类型的响应规律

2．3．7 产量和产量相关性状QTL在各基因组上的分布规律

2．3．8 A09基因组QTL簇的遗传解析

2．3．9 A09主效QTL簇与C08 QTL区域间的微共线性比较研究

2．3．10 A09 QTL簇区域的精细定位

2．4 讨论

2．4．1 产量性状的遗传决定和重要性状QTL的环境特异性研究

2．4．2 多群体多年多点实验在QTL定位中的应用

2．4．3 利用比较基因组学进行QTL区间的微共线性研究

2．4．4 传统QTL定位与基于全基因组SNP开展精细定位的结合

第3章 甘蓝型油菜品质性状的QTL定位和种子硫苷含量的遗传基础解析

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 试验材料

3．2．2 田间实验设计与性状考察

3．2．3 分离群体基因型检测

3．2．4 数据统计分析和QTL定位

3．2．5 硫苷QTL区域候选基因预测

3．2．6 种子硫苷含量全基因组关联分析

3．2．7 硫苷候选基因的分子克隆和序列分析

3．2．8 BnAPR3和BnIPMDH1硫苷基因CAPS标记的开发

3．3 结果与分析

3．3．1 甘蓝型油菜6个品质性状表型数据的统计分析

3．3．2 甘蓝型油菜6个品质性状的方差和遗传力分析

3．3．3 甘蓝型油菜开花期以及6个品质性状之间的遗传相关分析

3．3．4 甘蓝型油菜6个品质性状的QTL检测与分析

3．3．5 甘蓝型油菜6个品质性状对群体类型和自然环境的响应规律

3．3．6 品质性状consensus-QTL在各基因组上的分布规律

3．3．7 甘蓝型油菜种子硫苷含量QTL定位结果解析

3．3．8 种子硫苷含量QTL区间候选基因预测

3．3．9 甘蓝型油菜种子硫苷含量候选基因的分子克隆以及功能标记开发

3．3．10 A04连锁群种子硫苷含量主效QTL的研究

3．3．11 种子硫苷含量环境敏感位点检测

3．3．12 种子硫苷含量全基因组关联分析

3．3．13 种子硫苷含量GWAS定位与传统QTL定位的比较分析

3．3．14 A02基因组BnMYB28种子硫苷候选基因在甘蓝型油菜中的分子克隆

3．3．15 BnMYB28编码蛋白序列分析

3．4 讨论

3．4．1 甘蓝型油菜品质性状的遗传决定和环境特异性研究

3．4．2 影响双低甘蓝型油菜间种子硫苷含量表型差异的遗传位点的鉴定

3．4．3 连锁定位与全基因组关联分析相结合鉴定油菜种子硫苷含量遗传位点

3．4．4 种子硫苷含量对环境条件的响应研究

3．4．5 种子硫苷含量候选基因鉴定对甘蓝型油菜超低硫苷育种的意义

第4章 主要结论与创新点

4．1 研究总结

4．2 主要创新点

参考文献

全文缩略词一览表

附录

致谢

发表论文及参加课题一览表