荣昌猪及内江猪白细胞介素-8的克隆、原核表达以及生物学活性分析

摘要

本文根据Genbank上已发表的猪白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)基因序列(M86923)设计并合成了特异性引物，经ConA(刀豆蛋白素A)诱导荣昌猪外周血单核淋巴细胞(PBMC)，并以提取的总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增出474bp的目的片段，将其克隆到pMD18-T载体上，构成重组质粒pMD18-T-PIL-8，再从此重组质粒中扩增PIL-8的ORF，经酶切鉴定和序列测定证明该序列是猪白细胞介素-8。猪白细胞介素-8开放阅读框由312个核苷酸组成，推测其编码产物由104个氨基酸组成。经核酸序列分析比对后发现，荣昌猪及内江猪IL－8的序列完全一致，且与Genbank已发表的IL-8序列的完全一致，同源性为100％，揭示该序列在猪基因组中为一高度保守序列。 将克隆的猪IL-8基因亚克隆到原核表达载体PET-32a(+)上，构建重组表达载体pET-PUL-8。将质粒鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，用1mM的IPTG进行诱导表达重组猪IL-8蛋白。SDS-PAGE分析表明，在相对分子质量约为31kD(融合蛋白)处有明显的蛋白质表达条带，在2h表达产物量最高，而未经诱导的PET-32a(+)-IL8在31kD处无条带产生。提取并纯化pET-PIL-8的融合表达蛋白并用改进的琼脂扩散法检测其生物学活性，通过检验分析表明所获得的重组猪IL-8具有趋化猪外周血淋巴细胞的作用，具有较强的生物学活性。 本实验首次克隆出荣昌猪及内江猪IL-8基因，并在大肠杆菌中成功表达出猪IL-8蛋白，这为进一步研究猪IL-8在体内外的作用奠定了理论基础。表达产物活性分析发现，IL-8基因重组产物具有趋化猪外周血淋巴细胞的活性，这一结果提示，在机体抵抗感染的过程中，IL-8可能吸引参与免疫的细胞，通过对淋巴细胞的趋化作用来调节淋巴细胞的再循环，从而影响机体对抗原的识别和杀伤，促进免疫的发生，抵抗病毒和细菌对机体的感染，提高机体的免疫应答能力。同时随着研究的不断深入，为荣昌猪及内江猪作为免疫移植供体的可能提供理论依据。

目录

文摘

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论文说明：英文缩写词表

声明

文献综述 白细胞介素-8的研究进展

1来源和生理生化特性

2基因结构

3表达及调节

4生物学活性

5 IL-8受体

6 IL-8的实验室检测

7 IL-8的临床意义

8本实验的目的和意义

第一章荣昌猪及内江猪IL-8基因的克隆及序列分析

1材料

1.1试剂

1.2菌种和质粒

1.3实验动物

1.4溶液配制

1.5主要仪器设备

2试验方法

2.1猪外周血淋巴细胞的分离、培养及猪白细胞介素-8的诱导

2.2猪外周血淋巴细胞总RNA的提取

2.3荣昌猪及内江猪白细胞介素-8基因的RT-PCR扩增

2.4猪白细胞介素-8基因的克隆

2.5 pMD18-T-PIL-8质粒的鉴定

2.6荣昌猪及内江猪白细胞介素-8基因生物信息学分析

3结果

3.1荣昌猪及内江猪白细胞介素-8基因的RT-PCR扩增

3.2 pMD18-T-PIL-8质粒的PCR鉴定

3.3 pMD18-T-PIL-8质粒的测序鉴定

3.4猪白细胞介素-8基因生物信息学分析

4讨论

4.1猪外周血淋巴细胞的分离与培养

4.2猪外周血淋巴细胞总RNA的提取及防止RNA的降解

第二章猪白细胞介素-8在大肠杆菌中的表达及其生物活性分析

1材料

1.1主要试剂

1.2菌株与质粒

1.3实验所用溶液及其配制

1.4实验仪器

2方法

2.1 pMD18-T-PIL-8质粒中扩增猪白细胞介素-8基因的ORF

2.2重组表达质粒pET-PIL-8的构建

2.3 pET-PIL-8质粒的鉴定

2.4 pET-PIL-8质粒在大肠杆菌中的表达

2.5 pET-PIL-8重组表达产物的生物学活性分析

3结果

3.1 pMD18-T-PIL-8'质粒的PCR鉴定

3.2 pMD18-T-PIL-8'质粒的酶切鉴定

3.3 pET-PIL-8质粒的双酶切鉴定

3.4 SDS-PAGE分析pET-PIL-8质粒在大肠杆菌中的表达

3.5目的蛋白的表达量分析

3.6重组pET-PIL-8质粒的生物学活性检测

4讨论

4.1 PIL-8重组表达载体的构建

4.2 PIL-8的诱导表达

4.3 SDS-PAGE电泳

4.4 PIL-8的生物学活性分析

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况

附录