玉米木质素合成相关基因在干旱胁迫下的差异表达

摘要

干旱是玉米生产的主要非生物限制因素。耐旱性是众多形态结构与生理生化性质综合作用的结果，其分子机制非常复杂。研究玉米耐旱性的分子遗传特性，克隆与耐性相关的基因，研究其在干旱胁迫条件下的表达特性，可为功能基因选择标记的开发提供依据，以期通过分子标记辅助选择改良提高耐早性。 本研究以玉米耐旱自交系“81565”和不耐旱自交系“200B”为材料，用16％PEG模拟干旱处理，正常浇水为对照，分别于胁迫17，24和48h，取芯叶下第一片叶提取总蛋白。用等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶双向电泳分离总蛋白样品，GS-170光密度成相系统扫描2-DE凝胶，然后用PDQuest-6.0图象分析软件比对分析耐旱自交系和不耐旱自交系在干旱胁迫与对照条件下叶片蛋白质的表达差异。从12块样品胶生成的参照图谱中鉴定出的500多个蛋白点中，有58个在干旱胁迫条件下差异表达。其中，蛋白点2506，3507和4506在干旱胁迫下被诱导表达，最高表达量出现在胁迫24h。将这3个蛋白点酶切后，用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)根据酶切片段荷质比的不同来测定其分子量。然后在Mascot和Ms-Fit数据库中比对，根据MOWSE分值来鉴定蛋白质。点2506、3507和4506与拟南芥肉桂醇脱氢酶(CAD)、拟南芥细胞色素96A8(CYP96A8)和Elaeagnusumbellata的S-腺苷酸-L-甲硫氨酸合成酶(SAMS)的序列比对结果，MOWSE分值分别为66、68和68。 因为上述三个功能蛋白都参与木质素生物合成，所以在分析木质素合成途径生化过程的基础上，我们用实时定量PCR技术分析了耐旱性不同的玉米自交系，在干旱胁迫条件下，木质素合成关键酶—肉桂醇脱氢酶(CAD)和咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)的mRNA表达差异。在耐旱自交系“81565”、“200B”和“87-1”中，CAD和COMT的表达量在胁迫初期都有大幅度下降，但随着胁迫时间延长表达量又会明显回升；而在不耐旱自交系“丹340”中，CAD和COMT的表达量在胁迫初期大幅度下降后就再也没有明显的回升。 为在表型上进一步分析木质素合成与耐旱性的关系，我们选用“81565”、“87-1”、“200B”、“18-599”、“18-599M”和“ES40”6个耐旱性不同的玉米自交系，在不同干旱胁迫强度及正常浇水条件下，测定叶片本质素含量，同时调查雌雄花期间隔和单株籽粒产量，并转换为耐旱系数进行相关分析。结果表明，耐旱性不同的自交系的叶片木质素含量对干旱胁迫的反应大不相同。在干旱胁迫条件下，耐旱性较强的自交系木质素含量显著升高，平均耐旱系数较大，耐旱性中等的自交系木质素含量比正常灌水对照略有升高，耐旱性较弱的自交系木质素含量与对照相当或下降。在中等干旱和严重干旱条件下，叶片木质素含量平均耐旱系数与单株籽粒产量和雌雄花期间隔耐旱系数的相关系数，分别为r=0.848和r=0.889，均达显著水平。 综上所述，叶片的木质化是玉米对干旱胁迫的一种主动防御反应，木质素合成相关基因的差异表达与不同自交系的耐旱性有关，是造成其耐旱性差异的原因之一。在进一步研究这些基因与耐旱性分子遗传机制关系的基础上，可根据其在不同自交系中的单核苷酸多态性及表达调控方面的差异，开发功能基因选择标记，应用于玉米耐旱育种的分子标记辅助选择。

目录

文摘

英文文摘

声明

1文献综述

1.1植物耐旱的主要机理

1.1.1渗透调节作用

1.1.2抗氧化防御系统

1.1.3干旱胁迫诱导产生响应蛋白

1.1.4生物膜的修复

1.1.5代谢途径的改变

1.2木质素的研究

1.2.1木质素的功能

1.2.2木质素单体的生物合成

1.2.3木质素合成的调控

1.3蛋白质组学研究

1.3.1蛋白质组学的研究方法

1.4实时荧光定量PCR

1.4.1目标基因的定量方法

1.4.2实时荧光定量PCR常见方法

1.4.3实时荧光定量PCR在植物研究中的应用

1.5全长cDNA的扩增方法

1.5.1 cDNA文库筛选法

1.5.2 cDNA末端快速扩增法(RACE)

1.5.3电子克隆

1.5.4获得cDNA全长的其他方法

2材料和方法

2.1玉米叶片差异蛋白的分析

2.1.1选材及模拟干旱处理

2.1.2蛋白质样品的提取

2.1.3样品的浓度测定

2.1.4单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.1.5蛋白质的二维电泳

2.1.6双向电泳图谱分析

2.1.7蛋白质点的切取及酶解

2.1.8蛋白的质谱鉴定

2.1.9蛋白质数据库检索

2.1.10电子克隆

2.2.CAD和COMT基因mRNA表达差异的定量PCR检测

2.2.1总RNA提取及纯度检测

2.2.2引物设计与合成

2.2.3 cDNA第一链合成

2.2.4定量标准品的制备

2.2.5 PCR反应及分析

2.3耐早性鉴定与叶片木质素含量测定

2.3.1田间耐旱性鉴定

2.3.2叶片木质素含量测定

3结果与分析

3.1玉米叶片差异蛋白的分析

3.1.1干旱诱导产生的蛋白

3.1.2干旱诱导蛋白的匹配蛋白

3.1.3干旱诱导蛋白的编码基因

3.2 CAD和COMT基因mRNA表达差异

3.2.1 CAD基因

3.2.2 COMT基因

3.3.1自交系间耐旱性差异

3.3.2各自交系叶片木质素含量及其与耐旱性的关系

4讨论

4.1 CAD、CYP450和SAMS的生理功能

4.2 CAD、CYP450和SAMS在木质素合成中的作用

4.3木质素与玉米耐旱关系

4.4关于蛋白质双向电泳技术的改进建议

4.4.1提取方法的改进对玉米叶片总蛋白的样品浓度的影响

4.4.2蛋白质浓度测定体系改进对标准曲线和测定结果的影响

4.4.3不同丙烯酰胺浓度对蛋白质分辨率的影响

4.4.4两种方法提取的蛋白质样品双向电泳效果比较

4.4.5技术关键

4.4.6差异标准的制定

结语

参考文献

致谢