长毛兔白细胞介素-4（IL-4）基因克隆及真核表达

摘要

白细胞介素-4(interleukin-4；IL-4)是由活化的Th2细胞产生的具有多种生物学功能重要的细胞因子。兔白细胞介素-4是兔免疫调节系统中具有重要功能的细胞因子，尤其是在兔的体液免疫中起非常重要的作用。 1.本实验应用反转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，在国内首次从ConA诱导培养的长毛兔外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到IL-4基因，并将其克隆到pMD18-T载体中，经菌落PCR、酶切分析、序列测定鉴定及序列分析，克隆得到的IL-4基因(序列号：EF606761)的开放阅读框含有444个核苷酸，编码147个氨基酸，其中前24个氨基酸组成信号肽，成熟肽含123个氨基酸残基。与Genbank中已登录的欧洲兔IL-4基因(序列号：AF169169)的核苷酸序列和推知氨基酸序列同源性均为100％；与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、大熊猫和鼠等的核苷酸同源性在57.0％(大熊猫)～69.8％(人)之间；编码氨基酸同源性在43.0％(鼠)～53.6％(人)之间。构建的进化树结果都表明，兔与人的亲缘关系相对较近，与鼠的亲缘关系最远。 2.应用DNA重组技术，将克隆的长毛兔IL-4基因克隆到真核表达载体上pCDNA3.1(+)，通过菌落PCR的方法在转化子中筛选阳性克隆，用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切初步鉴定和序列测定进行了鉴定，结果证实真核表达质粒pCDNA3.1(+)IL-4成功构建。 3.将构建的重组真核表达质粒pCDNA3.1(+)/IL-4转染非洲绿猴肾细胞(COS7细胞株)，RT-PCR检测IL-4的转录表达；用兔淋巴母细胞增殖实验检测其在真核细胞中表达产物对兔淋巴细胞的刺激活性。结果表明：重组质粒转染COS7细胞株后，RT-PCR结果显示转染细胞总RNA中含有IL-4对应的mRNA；兔淋巴母细胞增殖实验证明转染后，表达的重组蛋白能够促兔外周淋巴细胞增殖作用，具有一定的生物学活性。 本研究首次成功克隆了长毛兔IL--4基因，构建了真核表达质粒，并进行了真核表达。本研究成果为了解各物种间白细胞介素序列的进化关系提供理论依据，同时也为进一步研究兔IL-4在体内外的作用及将其作为免疫增强剂与免疫治疗剂应用于临床奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述

1 IL-4结构特点

2 IL-4受体(IL-4R)

3IL-4激活的信号转导途径

4 IL-4的生物学功能

5IL-4有关疾病的研究及应用

5.1哮喘

5.2与过敏性疾病

5.3自身免疫性疾病

5.4治疗肿瘤

5.5基因工程

6实验目的和意义

1材料

1.1实验动物

1.2菌株和质粒

1.3主要试剂

1.4溶液配制

1.5主要仪器设备

2实验方法

2.1长毛兔IL-4基因的克隆与序列分析

2.1.1长毛兔外周淋巴细胞的分离培养

2.1.2淋巴细胞总RNA提取

2.1.3 PCR引物的设计

2.1.4长毛兔IL-4基因的RT-PCR扩增

2.1.5长毛兔白细胞介素-4基因的克隆

2.1.6重组质粒的提取和鉴定

2.1.7生物信息学分析

2.1.8克隆序列的GenBank登录

2.2长毛兔IL-4基因的真核表达

2.2.1 pCDNA3.1(+)／IL-4真核表达载体的构建

2.2.2 pCDNA3.1(+)／IL-4转染

2.2.3 RT-PCR检测COS 7细胞中IL-4基因的转录水平的表达

2.2.4 IL-4活性检测

3结果

3.1长毛兔IL-4基因的克隆

3.1.1总RNA提取

3.1.2长毛兔IL-4基因的RT-PCR扩增

3.1.3重组PMD18-T／IL-4质粒的菌落PCR

3.1.3重组PMD18-T／IL-4质粒的酶切鉴定

3.1.4重组质粒的测序鉴定

3.2长毛兔IL-4基因生物信息学分析

3.2.1长毛兔IL-4基因的序列分析

3.2.2同源性分析

3.2.3多序列比对和进化树的构建

3.3重组真核表达质粒pCDNA3.1／IL-4的构建和鉴定

3.3.1重组真核表达质粒pCDNA3-1／IL-4的菌落PCR鉴定

3.3.2重组真核表达质粒pCDNA3.1(+)／IL-4的双酶切鉴定

3.3.3重组真核表达质粒pCDNA3.1(+)／IL-4的测序鉴定

3.4转染细胞的RT-PCR检测

3.7重组长毛兔IL-4的生物学活性检测结果

4讨论

结论

参考文献

致谢