中国荷斯坦奶牛β-防御素基因LAP分子克隆及真核表达初步研究

摘要

防御素是广泛分布于动物和植物界的一类富含半胱氨酸的内源性阳离子抗菌肽，它在先天性免疫系统宿主防御机制中起着重要的作用。研究发现一些β-防御素基因在奶牛感染乳房炎时可在乳腺中诱导表达，表明在乳房炎发生时β-防御素可能在乳腺局部防御中发挥作用。本研究进行了β-防御素基因LAP的克隆与序列分析，构建了LAP基因的真核表达载体，并成功进行了真核融合表达。 实验以患乳房炎的中国荷斯坦奶牛乳腺为材料，提取乳腺上皮细胞总RNA，根据GenBank中注册的牛β-防御素基因LAP的cDNA序列设计了5’端带有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的一对引物，采用RT-PCR技术扩增LAP基因的cDNA序列，并将其连接到pMDTM19-T Simple载体中进行序列测定，将测序鉴定正确的克隆质粒命名为pMD19-T-LAP。生物信息学分析结果表明，本研究成功扩增出牛β-防御素基因LAP的编码区序列，大小为195bp，推导该序列编码64个氨基酸，并含有β-防御素的特征性分子结构即在特定位置上有6个保守的半胱氨酸残基（C）。与已报道的牛β-防御素基因LAP cDNA（登录号：EF630358．1）序列进行比较，核苷酸同源性达98％，有三个碱基发生了变异，分别为核苷酸序列第196的A-G突变、第199和201位的T-C突变；氨基酸同源性为95％，三个突变碱基引起第63位Arg→Lys的变异，这种核苷酸的序列差异，可能是由于牛的不同品种之间的差异造成的。 用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切重组克隆质粒pMD19-T-LAP，然后插入到pEGFP-C1载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点，构建了真核表达重组质粒pEGFP-C1-LAP，经质粒PCR、双酶切及测序鉴定，结果表明重组表达质粒pEGFP-C1-LAP构建成功。利用脂质体转染技术，将重组质粒转化到COS7细胞系，用荧光显微镜检测到增强型绿色荧光，分别提取重组质粒组和空载体对照组转染后细胞的总RNA，经RT-PCR检测表明重组质粒组LAP基因mRNA已经在COS7细胞内得到转录。 本试验结果为进一步研究奶牛β-防御素基因LAP的表达特性、基因功能及表达产物的抑菌活性奠定了一定的基础，同时重组多肽治疗和预防奶牛乳房炎提供了基础资料。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 文献综述

1 动物防御素研究进展

1.1 动物防御素的分类及分布

1.2 防御素的染色体定位

1.3 防御素的分子结构与特征

1.4 防御素的进化关系

1.5 防御素基因的表达调控

1.6 防御素的生物学作用

1.7 防御素的应用前景

2 研究目的与意义

第二章 中国荷斯坦奶牛LAP基因的克隆与序列分析

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2 感受态细胞与克隆载体

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器与设备

2 试验方法

2.1 引物设计

2.2 LAP基因的扩增及回收

2.3 LAP基因的连接转化与鉴定

3 结果

3.1 cDNA第一链的检测

3.2 RT—PCR结果

3.3 重组质粒pMD—19 T—LAP的鉴定

3.4 LAP基因序列测定及序列分析

4 讨论

第三章 中国荷斯坦奶牛LAP基因的真核表达载体的构建及其表达研究

1 试验材料

1.1 生物材料

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器与设备

2 试验方法

2.1 重组质粒pEGFP—C1—LAP的构建流程

2.2 目的基因的酶切及纯化

2.3 连接与转化

2.4 重组阳性转化子的鉴定

2.5 LAP基因在COS7 细胞中的表达与检测

3 结果

3.1 重组质粒pEGFP—C1—LAP的鉴定

3.2 LAP基因在COS7 细胞中的表达鉴定

3.3 RT—PCR检测

4 讨论

4.1 牛β—防御素基因的表达研究

4.2 关于真核细胞转染

4.3 β—防御素基因LAP与奶牛乳房炎防治

结论

参考文献

致谢

附图