在猪精液冷冻稀释液中添加褪黑素、谷胱甘肽、Vc对冷冻保存效果的影响

摘要

本试验以杜洛克猪为研究对象，用0．5ml细管精液冷冻剂型，对猪精液冷冻中的过氧化损伤，以及加入抗氧化剂后对精液质量的影响进行了研究。旨在进一步揭示猪精液冷冻过程中的过氧化损伤机理，筛选出较好的抗氧化剂加入冷冻稀释液，提高冷冻-解冻后精液质量。 用活性氧初级荧光测定试剂盒检测精子冷冻过程中活性氧含量的变化，平衡后，活性氧含量有轻微升高，冷冻-解冻后则急剧升高（P<0．01）。分别检测鲜精、平衡后精液及冷冻．解冻后精液质量指标：活率、活力、顶体完整性、线粒体活性，精液质量指标极显著下降（P<0．01）。用SPSS13．0分析发现精子中活性氧的含量与精子质量指标呈极显著强负相关，活率、活力、顶体完整性、线粒体活性与ROS含量相关系数分别为-0．879、-0．958、-0．819、-0．960。 比较不同的离心力、时间：2400×g，离心3min，800×g，离心10min。2400×g，离心3min能显著提高精子活率、活力、线粒体活性（P<0．05）。 首次在猪精液冷冻稀释液中加入褪黑素，浓度分别为0．125mg/ml，0．25 mg/ml，0．5 mg/ml。加入0．25 mg/ml褪黑素能显著提高精子活力、顶体完整率、线粒体活性（P<0．05）。 在猪精液冷冻稀释液中分别加入谷胱甘肽1mmol/L，5 mmol/L，及10mmol/L，结果5 mmol/L的谷胱甘肽能极显著提高精子冻后活率、活力、线粒体活性（P<0．01）。1mmol/L、5mmol/L的谷胱甘肽均能显著提高冻后精子顶体完整性（P<0．05），但是两浓度之间差异不显著。 首次对于褪黑素、谷胱甘肽及维生素C的联合添加采取正交设计的试验方法，用SPSS13．0分析，褪黑素与谷胱甘肽的交互作用显著，而其余两两组合之间交互作用不显著。同时发现维生素C的添加应避免稀释液中亚铁离子和亚铜离子的存在，以免催化维生素C的氧化，产生过氧化氢而损害质膜。 进一步分析褪黑素和谷胱甘肽的联合添加效应，加入0．125 mg/ml的褪黑素及1mmol/L的谷胱甘肽能显著提高解冻后精子活率、活力、顶体完整性和线粒体活性（P<0．05）。褪黑素与谷胱甘肽的联合添加比谷胱甘肽及褪黑素单独添加效果好。 综上所述，本试验推荐以2400×g，离心3min，联合添加0．125 mg/ml的褪黑素及1mmol/L的谷胱甘肽能取得较好的试验效果。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

1 文献综述

1.1 精液冷冻保存技术的研究概况

1.2 精液冷冻的研究简史

1.3 猪精液冷冻的研究现状

1.3.1 猪精液冷冻损伤机理

1.3.2 精液质量和冷冻操作对猪精液冷冻解冻后的质量的影响

1.3.3 精液品质检测方法

1.4 本试验研究的目的意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验动物

2.1.2 主要药品及试剂

2.1.3 主要仪器设备及耗材

2.2 试验方法

2.2.1 部分溶液的配制

2.2.2 猪精液冷冻程序

2.3 试验设计

2.3.1 冷冻过程中猪精子质量及ROS含量变化

2.3.2 冷冻稀释液中单独添加MLT、GSH对冷冻效果的影响

2.3.3 冷冻稀释液中联合添加MLT、GSH、Vc的正交试验

2.4 数据分析

3 结果与分析

3.1 冷冻过程中猪精子质量和ROS含量变化

3.1.1 冷冻过程中精液质量的变化

3.1.2冷冻过程中ROS含量变化

3.1.3 ROS含量与精液质量的相关性分析

3.2 精液不同离心力、时间的比较

3.3 冷冻稀释液中单独添加MLT、GSH的最佳浓度筛选

3.3.1 MLT对冷冻解冻后精液质量的影响

3.3.2 GSH对冷冻解冻后精液质量的影响

3.4 联合添加3种抗氧化剂的正交试验分析

3.4.1 组间比较F检验

3.4.2 组内比较t检验

3.5 单独添加与联合添加抗氧化剂的比较

4 讨论

4.1 ROS对精液质量的影响

4.2 离心力与时间对精液质量的影响

4.3 MLT、GSH、Vc对精液质量的影响

4.4 MLT、GSH、Vc联合添加对精液质量的影响

5 结论

参考文献

致 谢

图版及说明