APP基因缺失apxⅢC/Amp重组转移载体pBSL-Amp-R的构建

摘要

猪传染性胸膜肺炎（PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起的高度接触性呼吸道疾病，每年给我国的畜牧产业带来巨大的经济损失。本试验设计用APP血清3型菌S1421株为材料，用氨苄青霉素抗性基因替换其毒力蛋白的激活基因ApxⅢC，对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅢC基因缺失重组转移载体的构建进行了研究，内容如下： 1、 APP基因缺失apxⅢC-/Ampr+重组转移载体的左、右同源臂及氨苄抗性基因的克隆与鉴定。 根据NCBI发表的APP血清3型的全基因组序列，参照ApxⅢC上游和下游的部分基因，分别设计引物扩增1553 bp和1537 bp的序列作为重组转移载体的左右同源臂。将左同源臂（包含部分C基因）PCR扩增后直接TA克隆到pBS-TⅡ上；筛选获得的正向克隆命名为pBSLⅡ。将右同源臂TA克隆到pMP-19 simple载体上，命名为pMD-Ra。左、右同源臂经测序后与NCBI上公布的序列同源性均达到了99．99％。 根据pMD-19 simple载体的全基因序列，设计了一对引物扩增氨苄抗性基因，大小为861 bp。将其TA克隆到pMD-19 simple载体上，鉴定正确后命名为pMD-Amp。用HindⅢ和XbaⅠ分别双酶切卡那抗性的pVAX1质粒载体和pBSL-Amp，前者回收大片段后者回收小片段，将此二片段定向连接后转化入大肠杆菌中，复壮后涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB/X-gal平板中，挑选白斑抽取质粒进行酶切鉴定。HindⅢ和XbaⅠ双酶切后得到一条3000 bp和近2400 bp的条带。用引物Amp（U）和Amp（L）扩增氨苄抗性基因，得到一条近900 bp的条带，与预期结果相符。证明氨苄抗性基因可用ApxⅢC基因的启动子启动表达。氨苄抗性基因经测序与宝生物公布的序列同源性达到了99．9％。 2、APP基因缺失apxⅢC-/Ampr+重组转移载体的构建。 用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切pBSLⅡ和pMD-Amp，分别胶回收大片段和小片段；连接后得到中间载体pBSL-Amp。用XbaⅠ和SacⅡ双酶切载体pBSL-Amp和pMD-Ra，分别回收大片段和小片段；连接后得到重组转移载体pBSL-Amp-R。载体经酶切和PCR鉴定正确。

目录

文摘

英文文摘

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声明

文献综述

1猪传染性胸膜肺炎的病原学

1.1 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的发现及流行现状

1.2 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的传染途径

1.3 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的血清型

1.4 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的特征

2 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子及致病机制

2.1 猪传染性胸膜肺炎的临床症状和病理学特征

2.2 猪传染性胸膜肺炎的诊断

3 猪传染性胸膜肺炎的免疫预防

3.1 常规疫苗

3.2 基因工程疫苗

4 APP突变株构建方法的研究进展

4.1 自然突变

4.2 人工诱变

研究的目的与意义

材料与方法

1材料

1.1 细菌菌株与细胞

1.2 质粒与载体

1.3 主要药品及试剂

1.4 主要抗生素和培养基

1.5 细菌基因组DNA提取试剂

1.6 大肠杆菌感受态制备用试剂

1.7 主要仪器

2 方法

2.1 pBSL-Amp-R的左、右同源臂及氨苄抗性基因的扩增

2.2 重组转移载体的构建

2.3 重组转移载体的鉴定

结果

1左同源臂、氨苄抗性基因、右同源臂的PCR扩增

1.1 左同源臂的扩增

1.2 氨苄抗性基因的扩增

1.3 右同源臂的扩增

2 重组转移载体的构建

2.1 左同源臂、氨苄青霉素抗性基因和右同源臂的TA克隆

2.2 中间载体pBSL-Amp的鉴定

2.3 Amp 抗性基因表达的鉴定

2.4 重组转移载体pBSL-Amp-R的鉴定

讨论

1 亲本株的选择

2 打靶基因的选择

3 Ampr+基因作为抗性基因的选择

4 重组转移载体pBSL-Amp-R的构建

4.1 pBS-T II载体的选择

4.2 同源臂的选择

5 影响同源重组的效率

5.1 同源片段碱基错配的影响

5.2 同源片段长度的影响

5.3 外源DNA导入方法的影响

5.4 DNA 分子形态的影响

5.5 靶基因位点的影响

5.6 影响电转化效率的因素

结论

致谢

附录I

参考文献