猪繁殖与呼吸综合征病毒PPO3部分生物学性状稳定性研究及ELISA诊断方法的建立

摘要

本研究对实验室分离保存的猪繁殖与呼吸综合征病毒PPO3的理化特性和毒力性状的稳定性进行了测试。将PPO3病毒在-75℃下保存3年后，再经传代弱化，后续试验结果显示：该毒株在56℃下感作30min可被迅速灭活；氯仿等有机溶剂可迅速破环其囊膜结构；BUDR不影响病毒的有效增殖与复制；其在Marc-145细胞上形成以细胞圆缩、葡萄状聚集和大面积脱落为特征的细胞病变（接毒量为0.5mL/瓶），这与3年前陈杰[1]的试验结果基本一致。病毒在pH6.0～7.2时，毒力稳定，但随着传代次数的增多，该毒株对酸性环境（pH<5.5）的耐受性逐渐增强，细胞病变产生时间由原来的5天缩短为3-4天。通过对PPO3传代55代次，提取病毒的表面蛋白，经SDS-PAGE得到46.1KD、40KD、37.5KD、17.5KD和15.7KD的5条主要抗原蛋白条带，与原PPO3毒株的主要抗原蛋白基本一致。表明PPO3病毒表面蛋白稳定。 此外，通过对ORF6保守基因序列分析，设计合成了1对引物，并筛选出了最佳反应条件：95℃预变性5 min；95℃30s，56℃30s，72℃35s，进行35个循环，最后72℃延伸10min，成功获得了分子量为350 bp的特异性目的片段；而同时对HCV、PRV、PPV及Marc-145细胞进行同条件检测，结果均为阴性，从而进一步证实了PPO3为一株猪繁殖与呼吸综合征病毒。 传代试验结果显示，PPO3病毒在Marc-145细胞上连续传代55代次后，其TCID50为10-4.56/0.1mL，比原毒株（TCID50为10-3.6/0.1mL）对MARC-145细胞的感染性增强（P<0.05），差异显著。但抗体中和试验结果发现，经55代次的连续传代后，PPO3病毒对于抗体的中和效价有所增高，其抗体中和效价为1/7，而原PPO3毒株（保存3年的）的抗体中和效价为1/37，差异显著（P<0.05）。 本研究经纯化病毒，制作病毒抗原和高免血清（标准毒株制备），建立了间接ELISA诊断检测方法。经正交试验，最终确定抗原的最佳稀释度为1：40，抗体的最佳稀释度为1：5，阳性标准OD值为0.362，阴性值为0.019，空白对照值为0.004，标准SP值为0.4，并建立了PPO3 ELISA检测的标准曲线。通过对20个临床样品的检测，其中样品阳性血清检出率为80％，阴性检出率为20％，基本符合该猪场的实际情况。

目录

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论文说明：缩略词表

声明

1.文献综述

1.1 猪繁殖与呼吸综合征的研究历史及现状

1.2.PRRS的流行病学及免疫学

1.3 PRRS的病原学

1.3.1 PRRSV基本特征

1.3.2 PRRSV的分类

1.3.3 PRRSV的抗原性

1.3.4 抗体依赖性增强作用

1.3.5 PRRSV的细胞增殖特性

1.3.6 PRRSV持续感染

1.3.7 PRRSV的致病机理

1.3.8 PRRSV的抗原性变异

1.3.9 PRRSV的毒力变异

1.4 分子生物学

1.5 PRRSV的抗原蛋白研究

2.目的和意义

3.材料与方法

3.1 试验材料

3.1.1 毒株

3.1.2 细胞及细胞培养液

3.1.3 主要仪器设备和实验器材

3.1.4 主要试剂药品

3.2 试验方法

3.2.1 病毒的复苏培养

3.2.2 病毒的分子生物学鉴定

3.2.3 病毒的理化试验

3.2.4 毒力试验和中和试验

3.2.5 蛋白电泳(SDS-PAGE)

3.2.6 ELISA诊断方法的建立

4.试验结果

4.1 病毒的复苏与培养

4.2 RT-PCR扩增结果

4.2.1 特异性

4.2.2 敏感性

4.3 病毒理化指标

4.3.1 耐热性试验

4.3.2 脂溶剂敏感性试验

4.3.3 耐酸性试验

4.4 毒力试验和中和试验

4.4.1 病毒的传代弱化

4.4.2 毒力试验结果

4.4.3 中和试验结果

4.5 蛋白电泳(SDS-PAGE)

4.6 血清学试验

4.6.1 反应板均一性测定

4.6.2 抗原、抗体最佳稀释度的确定

4.6.3 阳性、阴性OD值的计算

4.5.4 待检样品的检测结果

5.讨论

5.1 病毒的复苏与培养

5.2 RT-PCR扩增结果及特异性

5.3 病毒的理化试验

5.4 PPO3 毒力变异分析

5.5 SDS-PAGE

5.6 PPO3 的血清学试验

6.结论

参考文献

致 谢