鸡CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因的克隆、表达及其在肉质中的遗传效应分析

摘要

钙蛋白酶系统在细胞内普遍存在，主要包括钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白。钙蛋白酶（calpain，CAPN）是生物体内普遍存在的钙依赖性半胱氨酸蛋白酶，在活体中参与肌肉降解等许多细胞过程，在动物宰后影响肉的嫩度。钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin，CAST）是一种内源性的、需Ca2+激活的钙蛋白酶抑制剂，可抑制肌肉蛋白质降解，屠宰后可抑制钙蛋白酶的活性，降低蛋白质水解。研究表明：钙蛋白酶系统基因参与肌肉生长过程中蛋白质的更新，并且与动物肌肉的增长和嫩度有密切的相关。 本研究以地方品种四川山地乌骨鸡为试验材料，克隆获得了山地乌骨鸡CAPN系统成员CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因的全编码区序列（GenBank accession numbers：FJ232589、FJ232590、FJ497056和FJ232592），并翻译获得其氨基酸序列（705aa、700aa、810aa和768aa）。通过生物信息学分析表明：CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST蛋白都是亲水的、都可能是一种潜在的跨膜蛋白。同时都存在着calpain家族的催化结构域和共同特征。CAPN1、CAPN2、CAPN3蛋白的氨基酸序列与其它物种的同源性较高，CAST蛋白的氨基酸序列与其它物种的同源性较低。 以地方品种四川山地乌骨鸡、藏鸡和培育优质鸡“大恒”S01系为试验材料，采用SYBR greenⅠ定量PCR分析CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因在1日龄和70日龄两个时间点品种间的表达差异，同时分析了四川山地乌骨鸡出生后1d、14d、28d、42d、56d、70d和84日龄等7个时间点CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因的组织表达差异和同一组织在不同时间点的发育性变化，以及CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST表达量的发育性变化同肌内脂肪含量、活重和冠重等三个表型性状累积生长值之间的关系。分析结果表明：除CAST基因在藏鸡的腺胃和肌胃组织外，CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因在同一组织中藏鸡和S01品系中基因表达量高于山地乌骨鸡。由此推测，CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因表达量与鸡的品种有关；CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因在四川山地乌骨鸡出生后的各个阶段都有表达，并且在不同阶段各有优势表达组织。胸肌和腿肌中CAPN1基因表达量的发育性变化与活重的累积生长值成显著地正相关，肌肉组织中CAPN2、CAPN3和CAST基因表达量的发育性变化与活重的累积生长值无显著地相关，但CAPN1、CAPN3和CAST基因在胸肌组织中都有表达的优势时间点。CAPN1基因在胸肌组织中表达规律在不同时间点总体呈上升的趋势，CAST基因在胸肌中表达量总体呈下降趋势，CAPN3基因在胸肌组织中表达规律总体呈先升后降的趋势。这与CAPN1、CAPN3和CAST基因在肌肉生长发育过程中理论表达量的规律很相似。胸肌组织中CAPN1分别与CAST和CAPN3表达量比值变化随机体的生长发育呈先升后降再升的趋势。由此推测，CAPN1、CAPN3和CAST基因表达量可能与鸡肌纤维的生长发育紧密相关，它们在鸡肌肉蛋白代谢中发挥重要调控作用。 以地方品种广东惠阳胡须鸡、封开杏花鸡、清远麻鸡、广西霞烟鸡和四川大恒优质鸡8个品系等12个品系或品种，共310个个体为试验材料，采用测序和PCR-SSCP的技术设计引物，扫描CAPN1、CAPN3和CAST基因外显子序列和邻近内含子序列。结果显示：在CAPN1基因中检测到4个单核苷酸突变位点，分别位于外显子5、外显子6、外显子16和3’非编码区。具体为2546位（SNP1）由C→T（反向测序），3535位（SNP2）由G→A，7198位（SNP3）由C→A和9950位（SNP4）由G→A（GenBank NO：NC_006090．1）。4个SNP位点构成16种单倍型，其中单倍型H1（C-G-C-G）、H2（C-G-C-A）和H5（C-A-C-G）为优势单倍型。CAPN1基因单倍型与12个品系或品种的屠宰性状关联分析结果显示：单倍型组合对活重、屠体重、半净膛率、胸肌率、腿肌重和腿肌率的遗传效应达到显著水平（P<0．05）。单倍型H1（C-G-C-G）对肌肉生长有负面效应，单倍型H9（T-G-C-G）和H13（T-A-C-G）对肌肉生长有正向效应。 在CAPN3基因中检测到2个单核苷酸突变位点，分别位于内含子8和外显子10。具体为11818位（SNP1）由T→A，12814位（SNP2）由T→G（GenBank NO：NC_006092．2）。2个SNP位点构成4种单倍型，其中单倍型H1（T-G）、H2（T-T）、H3（A-G）和H4（A-T）均为优势单倍型。CAPN3基因单倍型与12个品系或品种的屠宰性状关联分析结果显示：单倍型组合对半净膛率、胸肌率和腹脂重有显著地遗传效应。单倍型H1（T-G）对肌肉增长有负面效应，单倍型H2（T-T）对肌肉增长有正向效应，对腹脂重有负面效应。 在CAST基因中检测到3个单核苷酸突变位点，分别位于外显子8、外显子11和内含子11。具体为36127位（SNPl）由T→C，37752位（SNP2）由A→T，37868位（SNP3）由G→A（GenBank NO：NC_006127．2）。3个SNP位点构成8种单倍型，其中单倍型H1（T-A-G）、H2（T-A-A）、H3（T-T-G）和H4（T-T-A）为优势单倍型。CAST基因单倍型与12个品系或品种的屠宰性状关联分析结果显示：单倍型组合对活重、屠体重、半净膛率、全净膛率、胸肌重、胸肌率、腿肌重和腿肌率有显著地遗传效应。单倍型H3（T-T-G）对肌肉生长发育有正面效应，单倍型H5（C-A-G）和H6（C-A-A）对肌肉生长发育有负向效应。由此推测CAPN1、CAPN3和CAST基因可能是影响鸡屠宰性状的主效基因。 单突变位点与肉质性状关联分析结果显示：CAPN1基因对剪切力和失水率有显著影响，CAPN3基因对失水率有显著影响，CAST基因对肌苷酸含量有显著影响。三基因突变位点对肉质性能的遗传效应需要进一步研究验证。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:常用词语缩写

声明

第一章 文献综述

1.1 优质肉鸡的研究现状

1.1.1 优质肉鸡定义

1.1.2 鸡肉品质性状的研究

1.1.3 优质肉鸡研究及育种现状

1.2 家禽肌肉组织的发育与代谢调控

1.2.1 骨骼肌的发育

1.2.2 屠宰后肌肉代谢变化

1.2.3 家禽肌肉组织代谢调控关键因素

1.3 钙蛋白酶系统基因研究进展

1.3.1 CAPN1基因的研究进展

1.3.2 CAPN2基因的研究进展

1.3.3 CAPN3基因的研究进展

1.3.4 CAST基因的研究进展

1.3.5 钙蛋白酶系统在治疗疾病中的应用

1.3.6 钙蛋白酶系统的研究前景

1.4 分子标记技术及其在家禽育种中的应用

1.4.1 分子标记概述

1.4.2 目前检测基因突变的技术

1.4.3 目前检测基因表达的方法

1.4.4 MAS在家禽育种中的应用

1.4.5 分子标记技术的应用前景与展望

1.5 鸡肉质性状重要候选基因的研究概况

1.6 本研究的目的和意义

第二章 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因编码区的克隆及生物信息学分析

2.1 引言

2.2 材料和方法

2.2.1 试验材料

2.2.2 试剂与仪器

2.2.3 试验方法

2.3 结果

2.3.1 RNA质量

2.3.2 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因目的片段的扩增和克隆结果

2.3.3 目的片段的测序结果

2.3.4 鸡CAPN1基因生物信息学分析

2.3.5 鸡CAPN2基因生物信息学分析

2.3.6 鸡CAPN3基因生物信息学分析

2.3.7 鸡CAST基因生物信息学分析

2.3.8.鸡CAPN系统成员间序列分析

2.4 讨论

2.4.1 克隆cDNA序列分析

2.4.2 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST蛋白功能分析

2.4.3 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST蛋白确定序列特性分析

2.4.4 鸡CAPN系统成员间序列分析和保守域分析

2.4.5 蛋白质三维结构预测分析

2.4.6 系统发育分析

第三章 鸡CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因mRNA水平定量研究

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.2.1 材料

3.2.2 试剂和仪器

3.2.3 试验方法

3.2.4 统计分析

3.3 结果

3.3.1 常规PCR及测序结果

3.3.2 目的基因与管家基因的标准曲线及熔解曲线

3.3.3 荧光定量PCR扩增产物的特异性

3.3.4 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因的品种表达差异

3.3.5 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因的组织表达差异

3.3.6 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因表达的发育性变化

3.3.7 四川山地乌骨鸡各性状累积生长值

3.3.8 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因的相对表达量与性状的相关分析

3.3.9 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因表达量的倍比关系

3.4 讨论

3.4.1 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因表达量的品种差异

3.4.2 CAPN1基因相对定量结果及其与性状的相关分析

3.4.3 CAPN2基因相对定量结果及其与性状的相关分析

3.4.4 CAPN3基因相对定量结果及其与性状的相关分析

3.4.5 CAST 基因相对定量结果及其与性状的相关分析

3.4.6 CAPN1、CAPN2、CAPN3和CAST基因表达量的倍比关系

第四章 鸡CAPN1、CAPN3和CAST基因的多态位点筛选及其遗传效应分析

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 试剂和仪器

4.2.3 主要分子生物学软件

4.2.4 试验方法

4.2.5 统计分析

4.3 结果

4.3.1 基因组DNA提取结果

4.3.2 鸡CAPN1基因的多态性及遗传效应

4.3.3 鸡CAPN3基因的多态性及遗传效应

4.3.4 鸡CAST基因的多态性及遗传效应

4.4 讨论

4.4.1 鸡CAPN1基因的多态性及遗传效应分析

4.4.2 鸡CAPN3基因的多态性及遗传效应分析

4.4.3 鸡CAST基因的多态性及遗传效应分析

第五章 结论

5.1 论文结论

5.2 论文创新点

5.3 进一步的研究工作

参考文献

致谢

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