幼龄茶树在干旱胁迫下基因表达差异分析

摘要

茶树(Camellia sinensis(L.) O.Kuntze)是我国重要的经济作物之一，不仅栽培历史悠久，而且分布广泛。已有研究表明，我国西南部是茶树的起源中心，孕育了丰富的茶树种质资源，为优良品种的选育奠定了优良的基础。干旱是限制世界作物生产的主要环境因子之一，全球干旱、半干旱地区约占土地总面积的36％，占耕地面积的43％。我国干旱和半干旱地区面积约占全国土地面积的1/2，同时，随着全球温室效应的增强，对抗旱品种的选育将是未来品种的选育的一个重要方面。
　　 传统的茶树品种选育主要是通过系统选育和单株选育，但是有遗传背景复杂、遗传不稳定、选育时间较长、选育盲目性较大等缺陷，同时抗旱指标的选择多是以环境性状为主。分子育种直接在分子水平选育，通过对遗传物质DNA的筛选进行品种选育，能有效避免上述缺点。DD-PCR(差异显示PCR技术，或DDRT-PCR)有操作简便、灵敏性良好和效率较高的优点，本研究首次将技术成熟的差异显示PCR技术应用于茶树干旱环境下的差异表达基因的筛选。本实验意图将在干旱环境下有表达变化的基因片段作为以后抗旱品种研究和选育的一个筛选指标，对干旱品种的选育做出一定的贡献。通过实验得到了以下实验结果：
　　 1、幼龄茶苗利用试剂盒提取RNA的最佳部位是嫩叶和幼根，因为积累的次生产物少，对提取到的RNA污染少，但根部RNA保存较困难，降解较快，说明应用该试剂盒提取的RNA中有其他杂质，影响根部RNA的保存。
　　 2、PCR反应时用Mixmixture的扩增效果要好于传统的Taq酶体系；电泳条件是120mv，电泳1h左右；电泳所用凝胶浓度约为1.5％分离效果较好；取材部位为嫩叶时，退火温度为45℃时，扩增条带的假阳性较低，条带的重复性较好，取材部位为幼根时，根据处理时间，应适当降低退火温度；PCR反应参数以普通PCR反应参数为对照即可。
　　 3、经过PCR反应后，发现条带有上调表达、下调表达、常量表达三种表达量的变化；发现部分条带对锚定引物有一定的兼并性；通过引物筛选，确定了进行不同研究所需要的引物组合，以幼根为材料进行试验，需要重新确定胁迫剂浓度和胁迫处理时间。
　　 4、根据测序结果可以看出，茶苗在干旱胁迫处理下，有很多基因条带表达产生变化，部分条带的变化趋势和有研究者[94、951报道的酶活变化趋势相近。
　　 5、确定应用DDRT-PCR技术在茶树抗旱分子机制的探讨中是可行的，在所选择的茶树品种福鼎大白茶幼苗上取得的较好的实验效果，可以应用该方法对其它茶树品种及不同发育期茶树品种进行相关研究。

目录

文摘

英文文摘

缩写词及英汉对照

1．国内外研究现状和发展趋势

1.1 抗性指标研究进展

1.2 分子领域研究

2．本研究的目的、意义和方法

2.1 概述

2.2 茶树抗旱育种的研究现状及本研究的目的意义

2.3 本研究方法简介

3．材料与方法

3.1 材料

3.2 所用试剂

3.2.1 试剂盒类

3.2.2 溶液配制

3.2.3 测序公司

3.3 主要仪器设备

3.4 试验方法

3.4.1 材料预处理

3.4.2 材料处理

3.4.3 材料RNA的提取及完整性检验

3.4.4 逆转录RNA合成cDNA的第一链

3.4.5 cDNA的PCR扩增

3.5 筛选引物组合

3.6 目的条带的回收

3.7 目的片段与载体的连接

3.8 感受态细胞的制备和载体的转化及检测

3.8.1 感受态细胞的制备

3.8.2 载体的转化

3.8.3 转化子的筛选及检测

3.9 目的条带测序

4．结果与分析

4.1 形态变化

4.2 RNA提取比较

4.2.1 RNA提取效果检验

4.2.2 胁迫剂浓度确定

4.3 PCR相关条件探索

4.3.1 不同胶浓度确定

4.3.2 Taq酶反应体系和Mix反应体系比较

4.3.3 退火温度的筛选

4.4 引物筛选

4.4.1 以叶部、根部为材料初步进行引物筛选

4.4.2 引物筛选

4.5 目的片段的克隆测序

4.6 测序结果分析

5．结论与讨论

5.1 幼龄茶树中RNA提取

5.2 实验方法条件的优化

5.2.1 模板用量

5.2.2 引物的改进

5.2.3 退火温度

5.2.4 PCR扩增中的其他的条件

5.3 试验结果讨论

5.3.1 引物的简并性

5.3.2 根部RNA的降解

5.3.3 和目的片段相关的研究

5.4．结论

参考文献:

致谢

攻读硕士期间发表的论文