两种重要禾本科作物光敏色素B的研究

摘要

光敏色素是植物最重要感知环境光信号的受体。光敏色素B(PhytochromeB，PHYB)作为光敏色素家族的重要成员之一，在植物的很多生理进程中起着重要作用。本文对小麦和玉米的PhyB进行了基因克隆和表达模式分析研究，主要结果如下：
　　 1.小麦光敏色素B的克隆与表达分析1.1用玉米ZmPhyB1片段作为探针筛选异源六倍体中国春4‘D’染色体长臂的BAC文库，得到三个BAC阳性克隆，分别命名为BACA17-2，BE02，F02。根据小麦TaPhyB3的EST序列，设计特异引物进行扩增，得到3.5kb左右的DNA片段，测序结果表明该cDNA序列与GenBank中登录的一个来源于小麦光敏色素基因(登录号为AY888046)在核苷酸水平上一致性达99％，表明该cDNA克隆和AY888046为小麦光敏色素基因B在4D长臂的对应拷贝，将该cDNA序列定名为TaPhyB3。
　　 1.2通过同源比对，在外显子上设计特异引物进行PCR扩增，亚克隆后测序。按照GT-AG为内含子边界的原则，通过对所得TaPhyB-3基因组序列与cDNA的对比和扣除，得到TaPhyB3的基因组序列中的内含子、外显子和非翻译区域，其中TaPhyB-3包含4个外显子和3个内含子。4个外显子E-1到E-4分别位于1～2174、2500～3308、4313～4605和7246～7472bp处，3个内含子I-1到I-3分别位于2174～2500、3308～4313和4605～7246bp处。
　　 1.3小麦PhyB3基因的cDNA序列的编码区全长3501bp，预测该基因编码1165个氨基酸。通过同源性比较发现该蛋白含有其他一些常见物种中具有的保守结构域。该蛋白与水稻OsPHYB的相似性为93％，与玉米ZmPHYB的相似性为90％，与拟南芥AtPHYB的相似性为73％。
　　 1.4在黑暗、远红光、红光、蓝光和白光下，分别生长7d，胚芽鞘于黑暗中生长最快，长度达10mm左右，而在远红光、红光、蓝光和白光下，其长度随光强呈下降趋势。将小麦幼苗处理7d后，对不同光强下TaPhyB3的表达分析表明，TaPhyB3基因的表达在黑暗中最低，而在白光下表达水平最高，远红光、红光、蓝光和白光下的表达水平分别是黑暗中的2.2、7.7、7.4和37.3倍。TaPhyB3基因组织特异性的表达的结果表明TaPhyB3基因在地上部的表达明显要高于根中的表达，其中叶片中的表达水平是根的11.4倍之多。
　　 2.玉米光敏色素B的克隆与初步功能研究2.1提取玉米自交系B73幼苗的RNA，逆转录成cDNA。根据玉米ZmPhyB1和ZmPhyB2的EST序列，设计特异引物分别扩增ZmPhyB1和ZmPhyB2的两部分，得到大小为1.7kb的4个DNA片段，序列拼接后进行测序，测序结果表明它们分别与GenBank中登录的来源于玉米光敏色素基因(登录号为AY234827与AY234828))在核苷酸水平上一致性达99％以上，说明它们分别为ZmPhyB1和ZmPhyB2的对应拷贝。
　　 2.2利用NCBI数据库中ConservedDomian工具分别对ZmPHYB1和ZmPHYB2蛋白的保守结构域进行了分析，结果表明ZmPHYB1和ZmPHYB2蛋白都具有其他一些物种中编码的6个保守结构域，分别是DAFDOMAIN、PHYTOCHROMEREGION、PAS-ADOMAIN、PAS-BDOMAIN、HISTIDINEKINASERELATEDDOMAIN1和HISTIDINEKINASERELATEDDOMAIN2。同时通过比较还发现ZmPHYB1蛋白中还包含ZmPHYB2蛋白不具有的几个基序，两个假定的激活位点和两个血红素结合位点。
　　 2.3不同光诱导ZmPhyB1和ZmPhyB2表达的结果表明在自交系B73中，ZmPhyB1在远红光下的表达水平最高，在红光下的表达水平最低，大约只有白光下表达量的50％左右，ZmPhyB2在红光下的表达水平最低，在远红光下的表达水平最高，，远红光条件下的表达水平是红光下表达水平的1.7倍多；在自交系M017中，ZmPhyB1在黑暗条件下的表达水平最高，而在远红光条件下的表达水平最低，大约是黑暗条件下表达水平的50％左右，ZmPhyB2在红光和白光条件下的表达水平很高，在远红光下的表达水平最低，大约是黑暗条件下的表达水平的30％左右。
　　 2.4ZmPhyB1和ZmPhyB2组织特异性表达的结果表明白光下生长的叶片ZmPhyB1的表达水平最高，其次是在花柄中的表达水平，根中的表达水平最低。叶片中ZmPhyB2的表达水平同样是最高的，其次是叶鞘和花柄，茎、苞叶和根中的表达水平都较低。ZmPhyB1在经过黑暗处理的幼穗中的表达水平最高，在叶片中的表达水平次之，根中的表达水平最低。ZmPhyB2在经过黑暗处理的叶鞘中表达水平最高，在茎，叶片，苞叶和雄花四种组织中的表达水平次之，在根中的表达水平最低。
　　 2.5ZmPHYB1全长与ZmPHYA1的C端，ZmPHYA2的C端，ZmPHYA2全长均检测到强烈的互作信号；ZmPHYA1的C端和ZmPHYB1的N端检测到较弱的相互作用，而其它蛋白结构域区段之间没有检测到互作信号。AtCOP1的N端与ZmPHYB1的全长检测到较强的互作信号，ZmPHYB2的C端与AtSPA1的全长检测到较强烈的互作信号。
　　 2.6pJIM19-Hyg-HA-ZmPhyB1的转基因拟南芥TO代植株表现出叶柄和根的伸长，pJIM19-Kana-myc-ZmPhyB2转基因拟南芥TO代植株在抗性平板上正常生长，拟南芥幼苗为深绿色。转基因植株进行PCR鉴定的结果表明，ZmPhyB1和ZmPhyB2已经分别成功转入野生型Col-0和突变体PhyB-9。成熟的拟南芥转基因T1代植株进行抗性筛选时，具有抗性的植株和没有抗性的植株的分离比大约为3:1。pJIM19-Hyg-HA-ZmPhyB1转化突变体PhyB-9的转基因T1代植株的下胚轴缩短，子叶开张，表明ZmPhyB1已经成功互补PhyB-9突变体的表型，pJIM19-Kana-myc-ZmPhyB2转化突变体PhyB-9的转基因T1代植株不仅表现为下胚轴缩短，子叶开张，而且叶柄伸长，表明ZmPhyB2也成功互补了PhyB-9突变体的表型，pJIM19-Hyg-HA-ZmPhyB1转化野生型Col-0的转基因T1代植株表现为子叶面积变大，子叶之间的夹角变大，说明与野生型Col-0比较，转基因过表达植株的光形态建成特征更加明显，pJIM19-Kana-myc-ZmPhyB2转化野生型Col-0的转基因T1代过表达植株同样表现为子叶开张，子叶之间的夹角增大，下胚轴急剧缩短，和野生型Col-0比较光形态建成的特征也很明显。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

一.植物的光信号传导

1．光受体系统

2．光受体的作用

3．光敏色素B与其它光受体间的相互作用

4．光敏色素B的信号传递路径

5．拟南芥作为模式植物研究的优势

6．作物中光敏色素的研究现状

立题依据

第二章 小麦光敏色素基因TaPhyB3的克隆和表达分析

1．材料与方法

1.1 材料

1.2 总RNA的提取及DNA的去除

1.3 TaPhyB3基因cDNA序列的克隆

1.4 TaPhyB3基因组序列的克隆

1.5 TaPhyB3的同源性分析

1.6 半定量和实时定量RT-PCR分析

2．结果分析

2.1 TaPhyB3基因的克隆以及基因的结构

2.2 TaPhyB3基因核苷酸序列及推测编码的氨基酸序列分析

2.3 TaPhyB3基因的表达分析

3．讨论

4．结语

第三章 玉米光敏色素B的研究

1．材料与方法

1.1 材料

1.2 总RNA的提取及DNA的去除

1.3 ZmPhyB1与ZmPhyB2基因克隆

1.4 ZmPhyB和ZmPhyB2基因的鉴定

1.5 表达载体的构建

1.6 ZmPHYB1和ZmPHYB2蛋白的结构特征

1.7 ZmPhyB1和ZmPhyB2的表达分析

1.8 物理互作实验

1.9 转化拟南芥

1.10 转基因拟南芥的筛选和鉴定

2．结果分析

2.1 ZmPhyB1基因点突变结果

2.2 ZmPHYB1和ZmPHYB2蛋白的结构特征

2.3 ZmPhyB1和ZmPhyB2的表达分析

2.4 物理互作结果

2.5 转基因植株的表型观察和鉴定

3．讨论

4．结语

载体的PCR鉴定

载体的酶切鉴定

参考文献

致谢

附录

1．PMD-18T载体的示意图

2．PMD-19T载体的示意图

3．实验所用的表达载体图谱

4．BAC文库筛选出的阳性克隆的内含子序列

4.1 A17-2第1个内含子的测序结果

4.2 BE02第1个内含子的测序结果

4.3 F02第1个内含子的测序结果

4.4 A17-2第2个内含子的测序结果

4.5 BE02第2个内含子的测序结果

4.6 F02第2个内含子的测序结果

4.7 A17-2第3个内含子的测序结果

4.8 BE02第3个内含子的测序结果

4.9 F02第3个内含子的测序结果

5．TaPhyB3cDNA编码序列

6．TaPhyB3基因组序列

7．北京博迈德公司离心柱型质粒小提试剂盒操作步骤

8．北京博迈德公司离心柱型普通琼脂糖DNA回收试剂盒操作步骤

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