抗粗缩病RNA干扰表达载体的构建和玉米茎尖生长点原位转化

摘要

玉米粗缩病是由玉米粗缩病毒（Maize rough dwarf virus，MRDV）引起的一种世界性病毒病，通过灰飞虱进行持久性传播。近年来，由于玉米品种抗病性差以及耕作制度改变等原因，该病在我国玉米主产区流行，给玉米生产造成了严重的经济损失。因此，如何控制玉米粗缩病的危害，已是一个极具现实意义的问题。选育和推广抗病品种是防治玉米粗缩病最经济、有效的方法，然而，玉米对病毒病的抗性机制不清，遗传效应复杂，抗病种质狭窄，常规育种手段很难满足生产上对品种抗性的要求。
　　 RNA干扰现象是进化上保守的抵御外来核酸侵犯的防御机制。研究发现，将病毒来源的基因片段以反向重复的方式导入植物，其转录后形成的双链发夹RNA结构(hairpin RNA, hpRNA)可有效地引发病毒基因沉默，使转基因植物获得对该病毒及相近病毒的抗性。因此，本研究探索利用RNAi原理，将玉米粗缩病衣壳蛋白(cospidprotein，CP)基因的部分片段构建成RNAi载体，通过农杆菌介导原位转化玉米，筛选出具有玉米粗缩病抗性的转基因后代。
　　 首先对NCBI上提交的玉米粗缩病CP基因序列进行同源性分析，选择保守区域中的303bp片段作为RNAi靶序列。然后设计5对末端互补的引物，通过重叠PCR扩增获得模板序列。再利用两组带有酶切位点的特异引物扩增模板序列，分别正向、反向连入pSKintron载体，构建成具有反向重复结构的中间载体pMRNAi，其中，正反向片段之间间隔一段内含子序列，便利转录后形成发夹结构。最后，利用SpeI和XhoI限制性内切酶将pMRNAi载体上的反向重复序列切下，连接到植物表达载体pJIM19，构建成本试验的RNAi表达载体pERNAi。
　　 通过冻融法将表达载体质粒转入农杆菌菌株C58，以玉米自交系“昌7-2”茎尖生长点为受体进行原位转化，经0.2g/L草丁膦筛选后，将抗性植株移栽大田。用特异PCR引物分别扩增筛选标记基因Bar和目的基因片段，检测到3个阳性植株，阳性率为0.096％。对扩增片段的测序结果表明，外源基因已经成功导入玉米基因组。
　　 为了减少转基因过程中对组织培养的依赖和受基因型的限制，本研究开展了以玉米茎尖生长点为受体，农杆菌介导的原位转化方法，并对转化体系进行了优化，发现农杆菌菌液浓度为0D6000.7，侵染时间11min和添加0.02％表面活性剂SilwetL-77有利于抗性植株的获得。

目录

文摘

英文文摘

1文献综述

1.1 玉米粗缩病的概况

1.1.1 玉米粗缩病的危害

1.1.2 玉米粗缩病的病原及症状

1.1.3 玉米粗缩病的发病规律

1.1.4 玉米粗缩病的发生及防治

1.1.5 玉米粗缩病抗病遗传研究

1.2 RNA干扰及其在植物研究中的应用

1.2.1 RNAi的发现

1.2.2 RNAi的分子机制

1.2.3 RNAi的特点

1.2.4 RNAi技术在植物上的应用

1.3 玉米遗传转化的研究进展

1.3.1 玉米转化受体系统的研究

1.3.2 玉米转化方法的研究进展

1.4 本研究的目的和意义

2. 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株、质粒和引物

2.1.3 酶和试剂

2.1.4 培养基和抗生素

2.2 载体的构建

2.2.1 目的片段的获得

2.2.2 中间载体的构建

2.2.3 RNAi表达载体的构建

2.3 表达载体转化农杆菌

2.3.1 农杆菌感受态细胞的制备

2.3.2 冻融法转化农杆菌C58

2.4 玉米茎尖生长点的原位转化

2.4.1 侵染液的制备

2.4.2 受体材料的准备

2.4.3 侵染及培养

2.4.4 除草剂临界浓度筛选

2.4.5 抗性植株筛选与移栽

2.5 转基因植株的检测

2.5.1 玉米基因组DNA提取

2.5.2 选择标记基因Bar的PCR检测

2.5.3 目的基因片段的PCR检测

3. 结果与分析

3.1. 模板序列的获得与测序结果

3.2 载体的构建结果

3.2.1 pSKintron-R1质粒

3.2.2 pMRNAi质粒

3.2.3 RNAi表达载体pERNAi及其鉴定

3.3 农杆菌转化子的鉴定

3.4 玉米茎尖生长点转化的影响因素

3.4.1 农杆菌菌浓度的影响

3.4.2 侵染时间的影响

3.4.3 表面活性剂的影响

3.5 除草剂临界浓度和植株抗性筛选

3.6 抗性植株PCR检测结果

4 讨论

4.1 以茎尖生长点为受体的原位转化

4.2 关于RNAi载体构建

4.3 关于重叠PCR技术

5. 参考文献

致谢