猪IFN-α融合PPV VP2-PCV2 ORF2基因真核表达载体构建及免疫原性研究

摘要

干扰素(interfron， IFN)是病毒或干扰素诱生剂(Interferon inducer)进入动物机体后诱导宿主细胞产生的微量并具有广谱抗病毒和免疫调节等多种生物活性的一类细胞因子。猪α干扰素(PoIFN-α)可被用于免疫增强剂和猪病毒病的治疗。为探索PoIFN-α作为分子佐剂对核酸疫苗的免疫增强作用，本研究应用PCR技术从太湖猪肝脏基因组中扩增得到太湖猪IFN-α基因CDS区全序列，对其进行序列测定，然后将太湖猪IFN-α插入到pCI-VP2-ORF2质粒中，构建了融合表达载体PCI-IFN-α-ORF2-VP2。将该质粒转染PK15细胞后运用间接免疫荧光对PCV2的ORF2蛋白和PPVVP2蛋白进行检测。并以BALA/c小鼠为动物模型，分别运用pCI-IFN-a-ORF2-VP2、pCI-VP2-ORF2、pCI空载体、猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗通过肌注进行免疫，并于14天进行加强免疫。免疫后采集小鼠脾脏、外周血，运用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法检测了免疫小鼠脾脏淋巴细胞的转化功能、外周血中CD4+和CD8+淋巴细胞比例以及PCV2和PPV抗体效价。
　　 结果显示：太湖猪IFN-α基因在编码区具有三处突变，其中两处错义突变导致了编码氨基酸的改变。重组质pCI-IFN-a-ORF2-VP2转染PK后48小时运用间接免疫荧光可以检测到PCV2ORF2和PPVVP2蛋白的表达。运用该质粒免疫小鼠后能诱导小鼠产生良好的免疫应答，且重组质粒pCI-IFN-α-ORF2-VP2诱导的细胞免疫水平和PPV/PCV2抗体效价在二免后均高于或显著高于细小病毒灭活苗组、圆环疫苗组和ORF2/VP2组。这一结果表明PoIFN-α可以显著增强PCV2/PPV二联核酸疫苗的免疫效力，为进一步研制安全高效的PPV和PCV2基因工程多价疫苗提供了科学依据。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 猪IFN-a研究进展

1.1 干扰素的来源和分类

1.2 IFN-a基因及诱导表达

1.3 IFN-a生物学效应

1.4 IFN-a作用机制

1.5 IFN-a基因工程研究进展

2 猪细小病毒疫苗研究进展

2.1 常规疫苗

2.2 新型疫苗

3 猪圆环病毒及疫苗研究进展

3.1 PCV2概述

3.2 PCV2疫苗研究概述

3.3 基因工程疫苗研究进展

第二章 猪IFN-a基因的克隆及鉴定

1 试验材料

1.1 动物组织、菌株和载体

1.2 主要试剂及溶液配制

1.3 主要仪器设备

2 试验方法

2.1 IFN-a引物的设计与合成

2.2 猪肌肉组织基因组DNA的提取

2.3 IFN-a基因的RT-PCR扩增

2.4 PCR扩增产物的胶回收

2.5 PCR产物克隆

2.6 菌落筛选

2.7 质粒pMD-IFN-a的抽提

2.8 PCR鉴定及测序

2.9 测序结果分析

2.10 蛋白功能域和高级结构预测

3 结果与分析

3.1 总DNA抽提结果

3.2 猪IFN-α基因扩增结果

3.3 猪IFN-α基因序列分析结果

3.3 蛋白功能、高级结构及突变效应预测

3.4 编码蛋白信号肽预测

第三章 重组质粒PCI-IFN-a-ORF2-VP2融合表达核酸疫苗的构建

1 试验材料

1.1 菌株、质粒及细胞

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器设备

2 试验方法

2.1 重组质粒pCI-IFN-a-ORF2-VP2构建的技术路线

2.2 去除信号肽IFN-a基因引物设计与合成

2.3 VP2基因的引物设计

2.4 IFN-a的克隆

2.5 IFN-a基因及质粒PCI-VP2-ORF2的酶切回收

2.6 感受态E.coliDH5a的制备

2.7 回收产物连接转化

2.8 质粒抽提PCR扩增检测

2.9 双酶切鉴定

3 结果与分析

3.1 去除信号肽IFN-a基因扩增与克隆载体的构建

3.2 重组质粒PCI-IFN-a-ORF2-VP2真核表达载体的构建

第四章 质粒转染及重组质粒免疫原性检测

1 试验材料

1.1 主要试剂材料

1.2 主要溶液及配方

1.3 主要仪器设备

2 试验方法

2.1 重组质粒转染及表达产物的检测

2.2 核酸疫苗免疫小鼠后免疫效力检测

3 结果与分析

3.1 转染PK15细胞免疫荧光检测表达产物

3.2 脾脏淋巴细胞增殖情况

3.3 外周血T淋巴细胞亚群的动态变化检测

3.4 抗体检测

第五章 讨论

1 机体免疫应答机制

2 细胞因子作为基因佐剂

3 重组质粒核酸疫苗的免疫原性

4 实验中存在的问题及展望

第六章 结论

参考文献

致谢