两株携带猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原区域的减毒沙门氏菌的构建与免疫规律研究

摘要

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的以呕吐、腹泻、脱水和哺乳仔猪高致病率、高死亡率为主要特征的一种接触性肠道传染病，给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV的S蛋白是诱导产生保护性中和抗体的结构蛋白。本研究进行了S蛋白抗原区域的筛选，分别构建了携带PEDV S蛋白主要抗原区域S499-650和S499-789区域的重组减毒沙门氏菌疫苗，并以小鼠和仔猪为模型进行了口服免疫规律研究。
　　1.S基因的两种真核表达载体的构建与鉴定
　　根据GenBank中PEDV SC-L株S基因序列，设计特异性引物，采用RT-PCR技术扩增并克隆了S499-650、S499-789基因，并分别将S499-650、S499-789基因插入真核表达质粒pVAX1中，构建重组真核表达质粒pVAX-S499-650、pVAX-S499-789，然后转染COS-7细胞，通过间接免疫荧光及Western-blotting进行了蛋白表达鉴定，重组真核表达质粒可在COS-7细胞中表达目的蛋白，表达的蛋白可与兔抗PEDV阳性血清发生特异性反应，证明真核表达载体构建成功。
　　2.两株携带S基因的重组减毒沙门氏菌的构建及生物学特性研究
　　将真核表达质粒pVAX-S499-650、pVAX-S499-789分别电转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207，构建了重组减毒沙门氏菌菌株SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)。将这两株重组菌株分别以1×109 CFU/只剂量口服免疫小鼠，对重组菌株在小鼠体内的稳定性、携带目的基因在体内的转录、小鼠体内的增殖、对小鼠的安全性等菌株生物学特性进行研究。结果表明，SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)两株口服菌株均具有较高的稳定性;携带的目的基因可在肠道组织内转录;重组菌在小鼠肝、脾中增殖约5周后逐渐被机体清除;重组菌株对小鼠具有良好的安全性。本研究结果表明减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207可作为PEDV S基因不同抗原片段的呈递载体，为后续开展两种菌株的猪体口服免疫效果比较研究奠定了基础。
　　3.重组减毒沙门氏菌的口服免疫原性研究
　　将15头仔猪，分成5组，分别以1×1012 CFU/头剂量口服免疫重组菌株SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)，同时设PEDV灭活苗阳性对照免疫组和SL7207(pVAX)、PBS阴性对照免疫组，两周后加强免疫一次。在首免第0、2、4、6周采集免疫仔猪血清样品及黏膜样品，测定血清IgG与肠道黏膜抗体IgA的动态规律与中和活性、血清细胞因子IFN-γ、血清IL-4，外周血T淋巴细胞增殖实验。结果显示:SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)可诱导产生一定水平的血清IgG、黏膜IgA，且抗体具有良好的病毒中和活性，其中，口服疫苗诱导体液IgG的能力不如灭活苗，但诱导黏膜IgA的能力优于灭活苗;外周血T淋巴细胞增殖实验则表明SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)具有良好的免疫原性，可有效刺激T淋巴细胞的增殖;血清中细胞因子测定显示:SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)可激发IFN-γ的分泌，但对IL-4的分泌无明显刺激作用，表明二株口服疫苗菌株主要诱导Th1型T淋巴细胞免疫反应，后续将在攻毒保护试验方面继续深入完善评估。

目录

论文说明

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摘要

英文缩略词表

第一章 文献综述

1 PEDV研究概述

1．1 病毒的形态结构

1．2 基因组的结构特点

1．3 PEDV S基因及S蛋白

1．4 PEDV细胞受体研究

1．5 PEDV致病机理

1．6 PEDV流行情况

2 PEDV预防研究进展

2．1 PEDV灭活苗

2．2 PEDV弱毒苗

2．3 PEDV基因工程疫苗

2．4 抗PEDV抗体

2．5 PEDV单链抗体

2．6 抗PEDV植物提取物

3 减毒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的研究

3．1 沙门氏菌的入侵机制

3．2 减毒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的研究

3．3 减毒沙门氏茵作为DNA疫苗载体的应用

4 本研究的目的与意义

第二章 研究部分

1 材料

1．1 菌株、毒株及实验动物

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 PEDV S499-650、S499-789基因的克隆

2．2 重组质粒pVAX-S499-650、pVAX-S499-789的构建

2．3 携带PEDV S499-650、S499-789基因的减毒沙门氏菌的构建

2．4 重组减毒沙门氏菌的生物学特性研究

2．5 重组减毒沙门氏菌的免疫学特性研究

2．6 实验数据的分析

3 结果与分析

3．1 PEDV S499-650、S499-789基因的克隆

3．2 重组质粒pVAX-S499-650、pVAX-S499-789的构建

3．3 重组减毒沙门氏菌的鉴定

3．4 重组减毒沙门氏菌的生物学特性研究

3．5 重组减毒沙门氏菌的免疫学特性研究

4 讨论

4．1 目的基因的选择

4．2 关于减毒沙门氏菌及质粒的选择

4．3 目的基因在体内外的表达

4．4 关于重组疫苗的安全性及稳定性分析

4．5 关于重组疫苗的仔猪免疫原性研究

4．6 关于本研究的创新点与不足

5 结论

参考文献

致谢

附录