荣昌猪、长白猪免疫相关基因FKBP5的克隆、表达以及其表达蛋白质活性分析

摘要

本实验用RACE、qPCR、Western Blot、基因克隆、测序、表达蛋白等方法，克隆了荣昌猪、长白猪FKBP5基因cDNA全长、构建了FKBP5组织表达谱、表达纯化了FKBP5蛋白，得到了如下结果:
　　1、利用3'，5'末端快速扩增法(Rapid Amplification of cDNA Ends techniques，RACE)从荣昌猪和长白猪胸腺组织中首次克隆出荣昌猪、长白猪FKBP5基因。荣昌猪FKBP5基因cDNA全长为4119 bp，CDS区长为1374 bp，编码458个氨基酸的多肽，在5'端和3'端分别含有212 bp和2533bp的非编码区;长白猪FKBP5基因cDNA全长为4164bp，CDS区长为1374bp，编码458个氨基酸的多肽，在5'端和3'端分别含有255bp和2535bp的非编码区。
　　2、运用qPCR和Western Blot技术检测了该基因在荣昌猪和长白猪不同组织中的mRNA和蛋白表达谱，并且分析了FKBP5 mRNA在荣昌猪和长白猪各组织中的表达差异。研究结果表明，在所检测的组织中，心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、肌肉、性腺、胸腺中均有FKBP5基因表达，其中，在先天免疫相关组织胸腺中表达丰度最高，且显著性高于其它组织，并且FKBP5基因在长自猪胸腺组织中的表达量显著性高于荣昌猪胸腺组织表达量。
　　3、分别将荣昌猪、长白猪CDS区克隆进原核表达载体pET-28a，构建好的表达载体转化Rosetta蛋白表达菌，分离纯化出具有活性的荣昌猪、长白猪FKBP5蛋白。
　　该研究结果为进一步研究FKBP5基因对于T淋巴细胞增殖的功能研究奠定了基础，对深入研究猪抗病育种分子机理具有重要意义。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

1 文献综述

1．1 FKBPs家族概述

1．2 FKBPs分子结构和功能

1．2．1 FKBPs分子结构

1．2．2 FKBPs功能

1．3 FKBP5的分子结构、组织分布与功能

1．3．1 FKBP5的分子结构

1．3．2 FKBP5的组织分布

1．3．3 FKBP5功能

2 研究的目的与意义

3 材料和方法

3．1 实验材料

3．1．1 实验动物

3．1．2 样品采集

3．2 主要仪器设备

3．3 主要试剂盒

3．4 主要试剂及酶

3．5 载体、菌株和细胞

3．6 实验室常规实验方法及原理

3．6．1 总RNA提取

3．6．2 SMART-RACE-PCR技术

3．6．3 PCR扩增技术

3．6．4 琼脂糖电泳及胶回收

3．6．5 目的片段连接与转化

3．6．6 基因序列分析

3．6．7 RT-PCR及荧光定量PCR

3．6．8 Western Blot(免疫印迹)技术

3．6．9 FKBP5蛋白原核表达和纯化

3．6．10 FKBP5蛋白磷酸酶活性分析

4 结果与分析

4．1 FKBP5基因的克隆，序列及序列同源性分析

4．1．1 Total RNA质量鉴定

4．1．2 SMART cDNA的合成

4．1．3 FKBP5基因的克隆，序列及序列同源性分析

4．2 FKBP5基因组织表达谱

4．2．1 FKBP5 mRNA组织表达谱

4．2．2 荣昌猪、长白猪FKBP5基因表达差异

4．2．3 FKBP5蛋自表达谱

4．3 FKBP5蛋白原核表达

4．3．1 FKBP5原核表达载体构建

4．3．2 FKBP5蛋白诱导表达

4．3．3 FKBP5蛋白鉴定

4．3．4 诱导FKBP5蛋囱表达诱导剂浓度、诱导时间

4．3．5 FKBP5蛋白分离纯化

4．3．6 FKBP5蛋白磷酸酶活性分析

5 讨论

5．1 FKBP5基因的克隆，序列及序列同源性分析

5．2 FKBP5基因组织表达谱

5．3 FKBP5蛋白原核表达

6 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文