LPS对母兔下丘脑、卵巢和输卵管中TLR4、TLR2及其相关免疫细胞因子表达的影响

摘要

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，是TLR4和TLR2的共同配体，同时也是病原分子相关模式物(PAMP)的典型代表。作为一种内毒素，它能够诱导机体产生与感染革兰氏阴性菌相同的免疫应激过程。本研究中采用耳缘静脉注射一定量的LPS，模拟母兔自然状态下感染革兰氏阴性菌时的免疫应激过程。旨在研究革兰氏阴性菌感染对母兔下丘脑、卵巢和输卵管中TLR4、TLR2以及其下游免疫细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达的影响。通过荧光定量PCR检测TLR4、TLR2、IL-1β、IL-6以及TNF-α的转录水平，利用ELISA检测IL-1β、IL-6以及TNF-α的蛋白表达量。
　　荧光定量PCR结果显示:下丘脑、卵巢和输卵管中均有TLR4、TLR2、IL-1β、IL-6和TNF-α的转录，注射生理盐水后TLR4各个时间点转录水平与0h相比差异不显著（P＞0.05），TLR2在下丘脑中6h和输卵管中3h显著高于0h（P＜0.05），各个组织中1.5～12h，免疫细胞因子的转录水平与0h相比没有显著变化（P＞0.05）;LPS诱导后，与0h相比TLR4转录水平仅在卵巢中显著增加(P＜0.05)，在输卵管中1.5h、3h和12h显著低于0h(P＜0.05)，而TLR2转录水平在下丘脑中3h和卵巢中12h显著高于0h（P＜0.05），IL-1β转录水平在下丘脑中1.5h、3h和12h，卵巢中1.5～12h和输卵管中6h显著高于0h(P＜0.05)，IL-6在下丘脑中1.5～12h，卵巢和输卵管中1.5～3h显著高于0h（P＜0.05），TNF-α在下丘脑中1.5h、3h和12h，卵巢中1.5h和输卵管中1.5～3h显著高于0h(P＜0.05);实验组与对照组相比，TLR4转录水平仅在卵巢中12h显著高于对照组(P＜0.05)，TLR2在下丘脑中3h显著性高于对照组（P＜0.05），6h显著低于对照组(P＜0.05)，卵巢中12h显著高于对照组（P＜0.05），而输卵管中3h显著低于对照组（P＜0.05），IL-1β转录水平在注射后下丘脑中1.5h、3h和12h，卵巢中3～12h和输卵管中6h显著高于对照组（P＜0.05），IL-6转录水平在下丘脑中1.5～12h，卵巢和输卵管中1.5～3h显著高于对照组(P＜0.05)，TNF-α转录水平在下丘脑中1.5h、3h和12h，卵巢中1.5h和输卵管中1.5～3h显著高于对照组(P＜0.05)。
　　ELISA检测免疫细胞因子浓度显示:下丘脑、卵巢和输卵管中均有IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白的表达，对照组中，IL-1β和IL-6浓度在注射生理盐水后各个组织中1.5～12h的表达与0h相比没有显著变化（P＞0.05），而在注射后TNF-α浓度在输卵管中3～12h显著低于0h（P＜0.05）;LPS诱导后，IL-1β浓度在下丘脑中1.5～12h，卵巢中1.5～6h，输卵管中1.5h和6h显著高于0h（P＜0.05），IL-6浓度在卵巢中3h和输卵管中6h显著高于0h（P＜0.05），TNF-α浓度在下丘脑中3～6h和输卵管中1.5～12h显著低于0h(P＜0.05);实验组与对照组相比，IL-1β浓度在下丘脑中1.5～12h，卵巢中3～6h，输卵管中1.5h和6h显著高于对照组，IL-6浓度在下丘脑中12h，卵巢中3h，输卵管中6h显著高于对照组(P＜0.05)，TNF-α浓度在输卵管中1.5h显著低于对照组。
　　总体上说下丘脑、卵巢和输卵管中均有TLR4、TLR2的表达，但LPS诱导后，TLR4转录水平仅在卵巢中显著增加（P＜0.05），TLR2转录水平在下丘脑和卵巢中有显著增加（P＜0.05），而IL-1β、IL-6和TNF-α的转录水平在下丘脑、卵巢和输卵管中均显著增加(P＜0.05)，但IL-1β、IL-6和TNF-α对LPS免疫应激在不同器官存在差异:下丘脑对LPS引起的免疫应激反应快，持续时间长;卵巢和输卵管的免疫应激反应慢，持续时间短。

目录

论文说明

声明

摘要

1 文献综述

1．1 TLR2与TLR4的概述

1．1．1 TLR2与TLR4的发现及分子结构

1．1．2 TLR2与TLR4的相应配体及识别特点

1．1．3 TLR2与TLR4的信号传导通路

1．1．4 TLR2与TLR4的研究近况

1．1．5 TLR2与TLR4与动物繁殖疾病

1．1．6 TLRs的生物学意义及应用展望

1．2 免疫细胞因子概述

1．2．1 免疫细胞因子研究进展

1．2．2 免疫细胞因子与雌性动物繁殖疾病

1．3 本研究的目的和意义

2 材料方法

2．1 实验动物

2．2 试验材料

2．2．1 试剂药品

2．2．2 主要溶液的配制

2．3 主要仪器设备

2．4 试验步骤

2．4．1 总RNA的提取

2．4．2 反转录过程

2．4．3 实时定量PCR过程(以GAPDH为内参)

2．4．4 组织全蛋白的提取

2．4．5 蛋白质浓度测定

2．4．6 IL-1β、IL-6和TNF-α的ELISA检测

2．5 数据分析

3 结果与分析

3．1 总RNA的提取

3．2 标准曲线的制作

3．3 荧光定量PCR产物的特异性

3．4 LPS对TLR4在输卵管、卵巢和下丘脑中转录水平的影响

3．5 LPS对TLR2在输卵管、卵巢和下丘脑中转录水平的影响

3．6 LPS对输卵管、卵巢、下丘脑中IL-1β表达水平的影响

3．7 LPS对输卵管、卵巢、下丘脑中IL-6的表达水平的影响

3．8 LPS对输卵管、卵巢、下丘脑中TNF-α的表达水平的影响

4 讨论

4．1 LPS感染对下丘脑、卵巢以及输卵管中TLR4、TLR2转录水平的影响

4．2 LPS感染对下丘脑、卵巢以及输卵管中IL-1β表达的影响

4．3 LPS感染对下丘脑、卵巢以及输卵管中IL-6表达的影响

4．4 LPS感染对下丘脑、卵巢以及输卵管中TNF-α表达的影响

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文