甘油对猪冷冻精子细胞凋亡信号通路相关基因表达的影响

摘要

人工授精技术已经广泛应用于养猪生产，但猪冷冻精液人工授精的使用率仅约1％。与新鲜精液人工授精相比，猪冷冻精液人工授精配种后受胎率降低，窝产仔数减少。冷冻过程使得精子质膜和线粒体膜损伤、膜的通透性发生改变、精子获能样变化以及诱导精子细胞凋亡。尽管在冷冻稀释液成分及冷冻处理程序等方面做了大量研究，但关于猪精子的抗冻机制目前尚不清楚。因此，本研究从细胞凋亡的角度出发，系统分析冷冻保存过程中不同浓度甘油对冷冻-解冻后猪精子质量以及对细胞凋亡信号通路中相关基因表达以及Caspases蛋白酶活性的影响。结果如下:
　　(1)低浓度甘油(2％、3％)处理组，猪精子的活力、活率均显著高于其它浓度处理组(0％、5％、7％、10％、14％)。
　　(2)2％、3％甘油处理组的BCL-2/BAX比值显著高于其它浓度处理组(0％、5％、7％、10％、14％)。猪精子BCL-2/BAX表达量比值与Fas基因的表达量呈极显著负相关(r=-0.929，P=0.007)。
　　(3)3％甘油组中的Fas相对表达水平低于0％、2％、5％、7％、14％甘油处理组，且存在显著性差异。2％、3％甘油处理组FasL相对表达量显著低于0％和14％甘油处理组。
　　(4)3％甘油处理组中C aspas e-1相对表达量显著高于0％、2％、10％甘油处理组。Caspase-2基因在3％、14％甘油处理组的表达量显著低于0％、2％、5％、7％、10％甘油处理组，而2％甘油处理组中Caspase-2的相对表达量显著高于其它甘油处理组(0％、3％、5％、7％、10％、14％)。对于Caspase-6和Caspase-13基因，5％甘油处理组的表达水平显著高于其它甘油处理组(0％、2％、3％、7％、10％、14％)，而10％甘油处理组的表达量显著低于其它甘油处理组(0％、2％、3％、5％、7％、14％)。除10％甘油处理组外，3％甘油处理组中Caspase-8相对表达量显著低于其它浓度(2％、5％、7％、14％)甘油处理组。Caspase-8基因的相对表达量与BCL-2/BAX的比值呈显著性负相关（r=-0.819，P=0.024），而与Fas基因表达量呈显著性正相关（r=0.786，P=0.036）。Caspase-15相对表达量在0％甘油处理组显著高于其它浓度甘油处理组，10％和14％甘油处理组中Caspase-15相对表达水平显著低于其它浓度甘油处理组(0％、2％、3％、5％、7％)。
　　(5)不同浓度甘油处理均会显著降低精子Caspase蛋白酶活性水平。Caspase-3蛋白酶活性水平在甘油所有浓度处理组间均没有显著性差异。Caspase-6/9蛋白酶活性水平，在2％和3％甘油处理组精子中均显著低于0％甘油处理组，且显著高于5％、7％、10％、14％甘油处理组。3％甘油处理组精子的Caspase-8蛋白酶活性水平显著低于2％、5％和14％甘油处理组，却显著高于7％和10％甘油处理组。Caspase-8蛋白酶活性水平和Fas基因表达量具有显著性正相关（r=0.754，P=0.049）。
　　(6)0％、3％甘油处理组AnnexinⅤ+/PI+精子占总精子的百分比显著高于2％、5％、7％和10％甘油处理组，而2％、5％、7％和10％甘油处理组间无显著性差异。AnnexinⅤ+/PI+精子占总精子的百分比与Caspase-6/9蛋白酶活性呈显著性正相关（r=0.840，P=0.037）。

目录

论文说明

声明

摘要

1 文献综述

1．1 细胞凋亡概述

1．2 凋亡相关基因家族概述

1．2．1 BCL-2基因家族

1．2．2 Fas／FasL基因

1．2．3 Caspase基因家族

1．3 Caspase介导的细胞凋亡信号通路

1．4 细胞凋亡与精子发生发育

1．5 猪冷冻精液人工授精现状及存在的问题

1．6 精子冷冻损伤

1．7 冷冻保存对精子凋亡相关基因表达的影响

1．8 本试验研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验样品

2．1．2 试剂及试验仪器

2．2 试验方法及步骤

2．2．1 猪精液采集

2．2．2 试验设计

2．2．3 精液冷冻处理

2．2．3 Total RNA的提取

2．2．4．Total RNA质检

2．2．5 采用实时荧光定量(qRT-PCR)技术检测相关凋亡基因表达

2．2．6 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9／6蛋白酶活性检测

2．2．7 Annexin V-FITC染色

2．2．8 数据统计与分析

3 结果与分析

3．1 Total RNA质量检测结果

3．2 解冻后精子的活率和活力

3．3 目的基因qRT-PCR扩增有效性验证

3．4 凋亡相关基因qRT-PCR结果

3．5 Caspase蛋白酶活性检测

3．6 Annexin V-FITC染色

3．7检测结果的相关性分析

4 讨论

4．1 甘油对猪精子解冻后活力和活率的影响

4．2 甘油对猪冷冻精子凋亡相关基因表达的影响

4．3 甘油对猪冷冻精子Caspase蛋白酶活性的影响

4．4 甘油对猪冷冻精子磷脂酰丝氨酸外翻的影响

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文