四川阿坝地区药用植物内生拮抗放线菌的筛选及其防病促生机制研究

摘要

植物和内生菌经过漫长的进化，彼此之间早已形成和谐的共生关系。植物为内生菌提供营养物质;内生菌通过不同方式促进宿主植物生长发育，增强宿主植物抗胁迫能力。四川阿坝州具有独特的气候和生态环境，生长着多种多样的药用植物，为发掘植物内生放线菌提供了丰富的资源。
　　本研究选择10种分离培养基，从36种阿坝地区野生药用植物中分离得到737株内生放线菌。结果表明，选用的10种分离培养基中，棉子糖组氨酸培养基分离效果最好，葡萄糖天冬酰胺培养基分离效果最差。从药用植物的不同部位分离的放线菌数量有较大的差异，其中根部分布最多，占总数的37％，其次为叶和茎，分别占总数的29％和27％，其余部位如花和果实等，占总数不足10％。
　　从这737株内生放线菌中，通过平板对峙法和生长速率法逐级筛选，得到对稻瘟病菌有较强抑制作用的菌株。同时对这些菌株进行产铁载体、产纤维素酶、产吲哚乙酸和溶磷等促生指标筛选，最终筛选出3株具有抑制稻瘟病菌活性和促进植物生长双重功能的内生放线菌3-17、4-21、4-70。
　　通过形态和培养特征观察、生理生化指标检测和16S rDNA序列分析，将菌株3-17鉴定为Streptomyces exfoliates;菌株4-21鉴定为Streptomyces albidoflavus;菌株4-70鉴定为Streptomyces albus。
　　选取55株初筛具有抑制稻瘟病菌活性的内生放线菌，包括菌株3-17、4-21、4-70在内，进行Ⅰ型聚酮合酶PKSⅠ、Ⅱ型聚酮合酶PKSⅡ和非核糖体肽合成酶NRPS功能基因筛选，发现55株供试菌株中有31株菌含有PKS功能基因片段;有15株菌含有PKSⅡ功能基因片段;有18株菌含有NRPS功能基因片段，且几乎全部属于链霉菌属。结果表明，能抑制稻瘟病菌的内生放线菌具有合成聚酮类化合物及非核糖体肽类抑菌物质的潜力。菌株4-70与Streptomyces sp.KE1未知代谢产物的PKSⅠ氨基酸序列同源性为100％，说明该菌株具有产生聚酮类化合物的能力，可能通过非芳香环聚酮化合物产生抑制稻瘟病菌的效果。
　　通过显微镜观察和水解酶活力检测，发现内生放线菌3-17、4-21、4-70通过分泌胞外水解酶和生长竞争相互协同的机制来抑制稻瘟病菌。内生放线菌3-17、4-21、4-70无细胞发酵液不仅对稻瘟病菌有很好的抑制作用，且对稻瘟病菌孢子萌发及芽管伸长也有显著的抑制作用。根据结果推测菌株3-17、4-21也可能产生抑菌物质，但是抑菌物质的种类和合成途径还有待进一步研究探索。
　　采用内生放线菌3-17、4-21、4-70孢予混悬液灌根预处理水稻后，再接种稻瘟病菌，观测了离体水稻叶片防治效果;结果表明，内生放线菌灌根处理后，叶片病斑个数及直径大小均较对照组有明显的降低，能显著抑制水稻稻瘟病的发生。测定水稻叶片防御酶活性，发现菌株3-17、4-21、4-70处理组PAL、POD、LOX活性均高于对照组;菌株3-17、4-21处理组PPO活性高于对照组，但菌株4-70处理并不能显著增加水稻PPO活性;菌株3-17处理组AOS活性高于对照组，但菌株4-21、4-70处理组AOS活性与对照组差异不大甚至低于对照组。
　　采用内生放线菌3-17、4-21、4-70孢子混悬液灌根预处理水稻后，再接种稻瘟病菌，运用荧光定量PCR技术观测了水杨酸以及茉莉酮酸/乙烯信号转导途径中关键防御基因的表达情况，结果发现内生放线菌3-17、4-21、4-70主要都是通过水杨酸信号转导途径诱导水稻抗病性增强，从而达到防病促生的效果。
　　在盆栽温室培养条件下，内生放线菌3-17、4-21、4-70灌根预处理水稻苗均对稻瘟病表现出一定的防治效果。在盆栽促生研究中发现，无论接种稻瘟与否，内生放线菌3-17、4-21、4-70灌根预处理都能增强水稻幼苗根系活力。但是内生放线菌3-17、4-21、4-70单独灌根预处理，导致水稻幼苗植株地上部分变矮，根系变长而发达，其中菌株3-17和4-70增加叶绿素含量从而促进植株光合作用。当有稻瘟病菌存在时，内生放线菌3-17、4-21、4-70促进水稻幼苗地上部分增高，根系发达生长，其中菌株4-21增加叶绿素含量促进植株光合作用。内生放线菌3-17、4-21、4-70灌根预处理能促进水稻生长。
　　综上所述，本研究从阿坝药用植物中筛选到的内生放线菌3-17、4-21、4-70通过产生不同抑菌物质;分泌胞外水解酶和生长竞争相互协同;诱导宿主植物水杨酸信号转导途径;增强宿主植株光合作用及根系活力进而促进植株生长这四方面机制，达到防治水稻稻瘟病和促进植株生长的效果，并且能在水稻植株内有效定殖，具备开发成生防菌剂的潜力。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 植物内生菌

1．1 植物内生菌的生态分布

1．2 植物—内生菌—环境的关系

2 植物内生放线菌

2．1 内生放线菌物种多样性

2．2 植物内生放线菌的分类鉴定

2．3 内生放线菌代谢产物

3 内生放线菌生防机制研究

3．1 内生放线菌功能基因筛选

3．2 内生放线菌对病原菌的影响

3．3 内生放线菌诱导植物系统抗性

3．4 内生放线菌对宿主植物生长发育的影响

3．5 内生放线菌在宿主植物体内的定殖

4 研究的目的与意义

第二章 药用植物内生放线菌的分离及抑菌促生活性筛选

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 药用植物样品表面消毒处理结果

2．2 药用植物内生放线菌分离结果

2．3 内生放线菌对植物病原菌的抑菌活性筛选

2．4 药用植物内生拮抗放线菌促生指标筛选结果

3 讨论与结论

3．1 药用植物内生放线菌的分离

3．2 内生放线菌抑菌活性筛选

3．3 内生放线菌促生活性筛选

第三章 内生生防放线菌鉴定

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 内生放线菌形态学观察结果

2．2 内生拮抗放线菌培养特征结果

2．3 内生拮抗放线菌3-17、4-21、4-70菌株生理生化鉴定结果

2．4 内生拮抗放线菌16S rDNA序列分析

3 讨论与结论

第四章 内生拮抗放线菌功能基因筛选

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 内生放线菌Ⅰ型聚酮合酶PKS Ⅰ基因的分子筛选

2．2 内生放线菌Ⅱ型聚酮合酶PKS Ⅱ基因的分子筛选

2．3 内生放线菌非核糖体肽合成酶NRPS基因的分子筛选

3 讨论与结论

第五章 内生放线菌与稻瘟病菌的相互作用

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 内生放线菌对稻瘟病菌生长的抑制作用

2．2 内生放线菌对稻瘟病菌菌丝形态的影响

2．3 内生放线菌无细胞发酵液对稻瘟病菌生长的抑制

2．4 内生放线菌无细胞发酵液对稻瘟病菌孢子萌发的影响

2．5 内生放线菌产水解酶研究

3 讨论与结论

第六章 内生放线菌诱导水稻幼苗抗病性

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 各内生放线菌处理组水稻苗生长情况

2．2 内生放线菌诱导水稻抗病性离体试验

2．3 内生放线菌处理对水稻防御酶活力的影响

2．4 提取的水稻叶片总RNA的检测结果

2．5 防御酶基因引物特异性检测结果

2．6 防御基因荧光定量PCR扩增结果

2．7 不同内生放线菌处理对水杨酸信号转导途径的影响

2．8 不同内生放线菌处理对茉莉酮酸／乙烯信号转导途径的影响

3 讨论与结论

3．1 水稻叶片离体抗病效果

3．2 内生放线菌诱导抗性影响防御酶活性

3．3 内生放线菌诱导相关信号转导途径

第七章 内生放线菌对稻瘟病的防病促生效果

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 内生放线菌对水稻稻瘟病的盆栽防治效果

2．2 内生放线菌对盆栽水稻幼苗生长的影响

2．3 水稻幼苗生长参数结果

2．4 各处理组对水稻幼苗叶绿素含量的影响

2．5 各处理组对水稻幼苗根系活力的影响

2．6 回接菌株再分离

3 讨论与结论

第八章 结论与创新点

1 研究结论

2 创新点

3 存在问题及展望

参考文献

附录

致谢

攻读博士期间发表的论文