一株具防病、促生、抗旱功能植物内生贝莱斯芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明涉及一株可防治植物病害并具有促生、抗旱功能的植物内生贝莱斯芽孢杆菌及其应用。本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.9665。该菌株分离于植物根内，生长迅速，在植物根际能够快速大量定殖，具有生态位优势；菌株E6不仅对植物土传真菌病害具有高效防治作用，促进植物根系生长，提高植物抗旱性能，而且可以破坏病原细菌生物被膜的形成，不容易使细菌产生耐药性，比其它杀菌剂更有优势；其营养需求简单、生产成本低，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于农、林和园艺作物保护技术领域，特别涉及一株防治植物土传病害并具有促生抗旱功能的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。

技术背景

芽孢杆菌是一类分布广泛的革兰氏阳性杆状好氧型细菌，因其可以产生内生芽孢，具有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物等抗逆能力，容易被加工成制剂而得到广泛应用。目前用于植物病害防治的商品化芽孢杆菌主要为枯草芽孢杆菌制剂。例如，美国研制的枯草芽孢杆菌GB03、MBI600和QST713，日本东京技术研究所研制的枯草芽孢杆菌RB-14和NB-22，阿根廷研制的枯草芽孢杆菌RC8、枯草芽孢杆菌RC9和枯草芽孢杆菌RC11，澳大利亚开发的枯草芽孢杆菌A213，中国开发的枯草芽孢杆菌B903、B908、B916、 B1、B3和BS208等。近年来，已有研究报道应用Bacillus velezensis防治植物病害，但主要用于叶部病害如白菜黑斑病和土传病害如油菜菌核病的防治。与其亲缘关系较近的解淀粉芽孢杆菌，主要用于防治番茄灰霉病、稻瘟病、水稻细菌性条斑病、番茄枯萎病和青枯病。而针对生产中比较严重的黄瓜枯萎病、马铃薯粉痂病、姜瘟病等病害还缺乏高效的生防菌剂，生产上针对姜瘟病常使用的链霉素已经使细菌产生了抗性，铜离子制剂也导致病原细菌产生了耐铜基因簇，因此获得具有我国自主知识产权的可防治多种土传病害的多功能高效生防芽孢杆菌及其无细胞制剂是迫在眉睫的重要任务。

本课题组于2014年从中国农业科学院植物保护研究所廊坊基地的万寿菊根内分离到一株内生芽孢杆菌E6，被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，该菌株对黄瓜枯萎病、番茄根腐病、马铃薯粉痂病、姜瘟病、软腐病等多种病害具有抑制作用，其中对黄瓜枯萎病和马铃薯粉痂病具有强烈的抑制作用，防效可达80％以上，高于其他生防菌的防病效果。该菌株除了具有防病作用外，还可以提高植物的抗旱能力，是一株非常有应用潜力的菌株。

对于植物病害生防菌，提高制剂中的含菌量，降低生产成本，是实现生防菌大规模生产和应用的前提条件。目前国内外有关Bacillus velezensis菌株的发酵工艺研究较少，国内仅见两例报道(王振海等，2011；甄新武和乔均俭，2013)，这两例研究中所使用的Bacillus velezensis菌株是从猪粪便中筛选出来的，所需要的适宜发酵温度为37℃，但来自于万寿菊根内的芽孢杆菌E6适宜生长温度为28～32℃，其他营养需要也因其来源不同而有差异。即使同一种属的不同菌株对营养的需要也不尽相同。因此开展对植物土传病害具有高效防病作用生防菌Bacillus velezensis E6的发酵工艺研究，研制具有我国自主知识产权的生防菌剂对植物土传病害的防控具有重要的实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株防治植物土传病害并具有促生和抗旱功能的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。

本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌具体为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6菌株，该菌株已于2014 年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.9665。

本发明还保护活性成分为所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6的菌剂。

所述菌剂中还可包括吸附载体；所述吸附载体可为硅藻土、草炭、蛭石、稻壳粉、玉米芯粉、珍珠岩和碳酸钙中的至少一种。

更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述吸附载体具体由稻壳粉和硅藻土按照体积比2∶1的配比混和而成。

进一步，所述菌剂由所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6的发酵液，或对发酵液进行离心后所得菌泥与所述吸附载体按照1L∶1Kg至1L∶3Kg(如1L∶1Kg)的配比混和而成。

在本发明的一个实施例(实施例2)中，制备所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)E6的发酵液时采用大量发酵培养液，所述贝莱斯芽孢杆菌E6的发酵液中，所述贝莱斯芽孢杆菌E6的活菌数为80～ 130亿/mL(如80亿/mL)所述发酵液。其中，所述大量发酵培养液的溶剂为水，溶质及浓度如下：蔗糖 0.4～0.8％、玉米淀粉1.5～1.8％、豆饼粉1.2～1.5％和碳酸钙0.2～0.5％；其中，％表示质量百分含量。相应的，在所制备得到的所述菌剂中，所述贝莱斯芽孢杆菌E6的活菌数为40～1000亿/g(如1000亿/g)所述菌剂；所述菌剂的含水量在5～8％以内。

所述菌剂的制备方法也属于本发明的保护范围。

所述菌剂的制备方法，具体可包括如下步骤：

(1)培养所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6，得到所述贝莱斯芽孢杆菌E6的发酵液；在所述发酵液中，所述贝莱斯芽孢杆菌的活菌数为80～130亿/mL(如80亿/mL)；

(2)将步骤(1)所得发酵液或离心后的菌泥和所述吸附载体按照1L∶1Kg至1L∶4Kg(如1L∶1Kg) 的配比混和，得到所述菌剂。

在步骤(1)中，培养所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6的培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：蔗糖0.4～0.8％、玉米淀粉1.5～1.8％、豆饼粉1.2～1.5％和碳酸钙0.2～0.5％；其中，％表示质量百分含量。

更加具体的，所述培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：蔗糖0.5％、玉米淀粉1.7％、豆饼粉1.4％和碳酸钙0.45％；其中，％表示质量百分含量。

所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6的发酵液也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种用于防治植物土传病害、促进植物生长或提高植物抗旱性能的产品。

本发明所提供的用于防治植物土传病害的产品。

所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6或所述菌剂或所述发酵液在如下(1)或(2)中的应用也属于本发明的保护范围：

(1)防治植物土传病害、促进植物生长或提高植物抗旱性能；

(2)制备用于防治植物土传病害的产品

所述植物土传病害具体为由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、丝核菌(Rhizoctonia solani)、粉痂病菌(Spongosporasubterranea)、青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、软腐病菌(Pectobacteriumchrysanthemi、Erwinia carafavora)等病原真菌和细菌引起的土传病害。

所述植物具体可为黄瓜、番茄、马铃薯、姜、魔芋、小麦。

本发明还提供了一种防治植物土传病害的方法。

本发明所提供的防治植物土传病害的方法，具体可为如下(A)、(B)、(C)或(D)：

(A)包括如下步骤：向植物种子中加入所述菌剂稀释液，进行拌种后播种。所述的菌剂稀释液的浓度为0.1亿/mL；

(B)包括如下步骤：将所述植物的根系置于所述菌剂的稀释液中浸泡，浸泡后栽种，并在生长期灌根。所述的菌剂稀释液的活菌数为0.1亿/mL；

(C)包括如下步骤：所述菌剂与育苗基质混和，然后将所述植物播种于育苗基质中；

(D)上述(A)、(B)、(C)方法的两两任意组合或三种方法的组合使用。

在所述(A)中，所述菌剂中所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6的活菌数为40亿/g；所述植物种子与所述菌剂(所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6的活菌数为40亿/g)的混和配比具体可为1∶1(质量比)。进一步，所述拌种具体为：将所述菌剂(所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) E6的活菌数为40亿/g)与水按照1g∶400mL的配比稀释成稀糊状物，再向其中加入与所述菌剂等质量的所述植物种子进行搅拌。

在所述(B)中，所述菌剂的稀释液中所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6的活菌数为0.1 亿/mL；所述浸泡的时间为30min。

在所述(C)中，所述混和后基质中所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6的活菌数为0.1亿 /g；

在所述(D)中，所述菌剂的浓度与所述的(A)、(B)、(C)中各自的使用浓度一致。.

本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6CGMCC No.9665具有如下优势：

1、该菌株分离于植物根内，更能适应植物根际环境，而且生长迅速，能够在植物根际快速大量定殖，具有生态位优势。

2、目前常用的细菌杀菌剂或铜离子杀菌剂在长期使用后易导致细菌产生抗药性，而增加病害防治的难度。而该菌株无菌发酵滤液可显著抑制病原细菌青枯病菌和软腐病菌生物膜的形成，是通过干扰细菌之间的信号传递以及外面包裹的被膜来抑制细菌，是一种新的作用方式，这种作用方式不容易使病原细菌产生抗药性，比其它杀菌作用方式更有优势，该菌株是一株有潜力的拮抗菌。

3、对多种植物病害具有高效防治作用，还能促进植物生长并提高植物的抗旱性能。

4、该菌株的营养需求比较简单，发酵周期短，成本低，容易大规模生产和商品化应用。

本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6CGMCC No.9665是2014年从中国农业科学院植物保护研究所廊坊基地的万寿菊根内分离到一株内生细菌。该菌株的特点是：在营养培养基平板上培养时，菌落突起形成皱褶，菌落扩展速度很快，这是生防菌可大规模生产和应用的前提条件之一。对黄瓜枯萎病、番茄根腐病、马铃薯粉痂病等多种病害具有抑制作用。该菌株除了具有防病作用外，还可以提高植物的抗旱功能，是一株非常有潜力的菌株。经鉴定，该菌株为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，定名为E6。该菌株对黄瓜枯萎病和马铃薯粉痂病具有强烈的抑制作用，防效可达80％以上，高于其他生防菌的防病效果。而且可以通过破坏病原细菌生物被膜形成抑制细菌生长，避免大量使用可能造成病原细菌产生耐药性的几率。E6菌株发酵培养时，生长速度快、28小时之内可完成发酵，发酵结束后活菌数可达到80～130亿/mL，成产成本低。因此E6是一株非常有潜力的植物土传病害生防菌，从而提出了本发明。

保藏说明

菌种名称：贝莱斯芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus velezensis

菌株编号：E6

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2014年9月15日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.9665

附图说明

图1为小麦受到干旱胁迫1天后的生长状况图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6的分离与鉴定

(一)芽孢杆菌E6菌株的分离

本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6是从万寿菊根内，对组织研磨液进行稀释涂布后分离获得的，分离方法为：

(1)贝莱斯芽孢杆菌的分离：在河北省廊坊市农科院试验基地，采集万寿菊等植物的根。称取1g根，用1％NaClO消毒水洗后，放入无菌研钵中研磨，用移液枪从研钵中吸取1mL研磨液，加入另一盛有9mL 无菌水的试管中，混和均匀，以此类推分别制成10^-3、10^-4、10^-5不同稀释度的溶液。取100μL稀释液涂布于TSA培养基平板上，每个梯度涂布三个培养皿，27～30℃培养2～4天。挑取不同形态的细菌，转接到营养琼脂培养基(即NA固体培养基)上划线纯化。

其中，所述TSA培养基组分及配比为：胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，调pH到7.0，121℃高压灭菌30分钟。

所述NA固体培养基组分及配比为：葡萄糖10g、蛋白胨10g、牛肉膏3g、酵母膏1g、琼脂18g、蒸馏水1000mL，调pH至7.0，121℃高压灭菌30分钟。

(2)芽孢杆菌E6对病原真菌的抑制作用

将活化好的尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌、立枯丝核菌等病原真菌，用5mm打孔器制成菌饼接种在PDA 平板中央，距菌饼2cm处点接所述的贝莱斯芽孢杆菌E6，3次重复，以只接种病原菌的作为空白对照。26℃下培养3～4天测量菌落直径，计算菌落生长抑制率。结果表明，芽孢杆菌E6对上述病原真菌均有抑制作用。

表1芽孢杆菌E6对病原真菌的抑制作用

(3)芽孢杆菌E6对病原细菌的抑制作用

对病原细菌生长的影响：取出，4℃冰箱保存备用。

将青枯病菌、软腐病菌和贝莱斯芽孢杆菌E6菌株转接到5mL牛肉膏蛋白胨液体培养液中，30℃， 180转/分震荡培养，青枯病菌和软腐病菌在培养12～18小时后，血球记数板计数，调整病原菌菌悬液浓度为10⁸/mL。吸取100μL病原菌培养液，加入到牛肉膏蛋白胨培养基平板上，涂布，晾干。贝莱斯芽孢杆菌E6在培养48h后，转移到离心管中，4℃、10000转/分，离心10分钟，上清液过0.22μm滤膜，备用。将牛津杯放在涂布病原菌的培养基上，加入200μL贝莱斯芽孢杆菌E6的无菌发酵滤液，每个病原菌做3>

对病原细菌生物被膜形成的抑制作用：

将150μL病原细菌悬浮液分别添加于平底96孔聚苯乙烯细胞培养板内，然后加入50μL贝莱斯芽孢杆菌E6的无菌滤液，置于28～30℃培养箱内静置培养2小时，用移液枪将培养液及没有粘附到培养板的病原细菌吸掉，用磷酸缓冲液轻柔地漂洗两次，最后粘附在细胞培养板表面的是生物被膜的初始菌落，然后加入200μL的牛肉膏蛋白胨液体培养液，静置培养24～36小时至生物被膜形成。观察菌体浑浊度和表面成膜情况。结果表明，菌株E6无菌发酵滤液显著抑制病原细菌生物被膜的形成，抑制率分别为43.0％和 45.8％。

(四)芽孢杆菌E6菌株的鉴定

提取菌株E6的基因组DNA，用通用引物27f和1492r扩增16S rDNA序列，并进行测序。

27f：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；1492r：5′-TAC GGC TAC CTT GTTACGACT T-3′。

菌株E6的16S rDNA的序列已经提交GenBank，登录号为MG550967。鉴于上述分子生物学特性鉴定结果，将步骤一分离并纯化得到的菌株E6鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。该贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)已于2014年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.9665。

实施例2：

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6菌剂的制备

1、将实施例1获得的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)E6CGMCC No.9665的菌苔移植到营养肉汤(NB)中，28～30℃摇床振荡培养20h得到种子液。

其中，营养肉汤(NB)的配方为：葡萄糖10g、蛋白胨10g、牛肉膏3g、酵母膏1g、蒸馏水1000mL， pH调至7.0～7.2，121℃高压灭菌30分钟。

2、按1％比例(体积比)将步骤1获得的种子液接种到大量培养发酵培养液中，培养温度30～32℃，转速150～180转/分，初始pH 7.0～7.2，培养时间28h。发酵完成后得到发酵液，发酵液中贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillus velezensis)E6CGMCC No.9665的活菌数可达120亿/mL。

3、将步骤2获得的贝莱斯芽孢杆菌发酵液经离心获得的菌泥与吸附载体——稻壳粉和硅藻土(体积比2∶1)按照体积质量比为1∶1(即1L∶1Kg)的比例混和均匀，即得菌剂。所述离心转速为11500转/分，离心时间为30分钟；所述的菌剂中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)E6CGMCC No.9665的活菌数可达1000亿/g，含水量在5％以内。

实施例3：芽孢杆菌E6菌剂的防病作用

对黄瓜枯萎病的防治效果：先用Armstrong培养液对镰刀菌进行培养，3～4天后镜检计数，将菌液稀释至5×10⁴cfu/mL备用；将E6菌剂稀释至1×10⁷cfu/mL。将镰刀菌的孢子悬浮液与E6菌剂等体积混和，然后将消毒好的种子加入混和液中浸种30分钟。每处理10个重复，每个重复播种3粒黄瓜种子，以不施用菌剂的处理作对照。播种3周后调查黄瓜的生长发病情况。

所述的Armstrong培养液的组分和配比为：葡萄糖20.0g，KCl 1.6g、MgSO₄.7H₂O0.4g、Ca(NO₃)₂>2PO₄1.1g，FeSO₄0.2μg/mL，ZnSO₄0.2μg/mL、MnSO₄0.2μg/mL，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌30min。

其中，FeSO₄、ZnSO₄、MnSO₄可先配成母液。即分别称取上述三种药品0.02g于100mL蒸馏水中，混合均匀后取1mL于上述999mL混合液中即可。

调查结果(表2)表明，E6菌剂对黄瓜枯萎病的防效可达84.2％。

表2 E6菌剂对黄瓜枯萎病的防病效果

对番茄根腐病的防治效果：

收集丝核菌的病土，与无菌的育苗基质按照质量比1∶1的比例混和，然后装入16.5cm×11.5cm的方形育苗盒中。在病土中挖开一条宽约4cm，深6cm的小沟。将E6菌剂与无菌基质混和，使其终浓度为10⁶cfu/g，然后将菌剂撒入沟中，将番茄苗移栽到沟中，并用稀释后的菌剂封沟，每条沟约需要撒施菌剂20g。每处理3个花盆的重复，每盆移栽10株苗，移栽后放到温室培养，温度为白天32℃，晚上22℃。于移栽9天后调查发病率，计算防病效果。结果(表3)表明，E6菌剂对番茄根腐病的防效可达69.3％。

表3病土法测定E6菌剂对番茄根腐病的防病效果

对马铃薯粉痂病和早疫病的防治效果：

用E6菌剂处理马铃薯种薯，用量为1000g/亩，对照为甲基托布津拌种，用量为300g/亩，生长期结束时挖出薯块调查，发现E6菌剂处理后的薯块表面光滑，马铃薯粉痂病的病情指数明显减轻，防效可达 86.58％；亩产量增加17.2％(表4)。

表4 E6菌剂种薯处理对马铃薯粉痂病的防治作用

实施例4：芽孢杆菌E6的促生抗旱功能

取田间土，装到花盆中。小麦种子用菌剂浸种后播种于土中。E6菌剂浓度为10⁸cfu/g，每盆播种20>

调查结果表明：E6菌剂处理小麦种子，可促进植株生长(表5)，根系发达；受到干旱胁迫后，生长良好，颜色深绿，而对照叶片发黄(图1)。

表5 E6菌剂对小麦种子萌发和生长的影响