控制水稻粒型基因GLW2的功能验证及调控机理

摘要

水稻是我国重要的粮食作物，其产量高低涉及粮食安全。水稻产量构成要素主要包含有效穗数、穗粒数、粒重、结实率等，其中粒重主要是受粒型和灌浆影响。尽管已经有一些粒型相关基因被报道，但其调控粒型的分子机制仍不十分清楚。本实验室在育种过程中发现了一份育种中间材料307R，其主要特征为籽粒明显增大，千粒重达64g。在前期的研究中，通过系统的遗传分析确定307R中存在一个显性主效基因调控籽粒粒型及粒重;构建了以IR24，MH63和527R为背景高世代回交的近等基因系;通过细胞学观察发现307R大粒性状是由于细胞的增大和数量增加所致;同时通过构建BC3F2群体及重组纯合体分析将该基因定位于2号染色体长臂端15.3kb范围内，确定编码生长发育调控因子家族蛋白OsGRF4为候选基因，并将该基因命名为GLW2(Grain Length and Width2)。本研究在上述基础上对GLW2的功能进行了验证，并确定了该基因的上游调控因子和下游互作蛋白，基本明确了GLW2控制水稻粒型粒重的遗传机理，结果如下:
　　1、以2x35S为启动子，对OsGRF4进行过量表达。结果显示，过表达阳性植株籽粒粒长、粒宽及千粒重均极显著高于对照;细胞学观察发现，过表达阳性植株外稃表皮细胞明显大于对照。利用CRISPR/Cas9技术对NIL-527R中OsGRF4进行基因编辑，结果表明基因敲除植株籽粒粒长、粒宽及千粒重均极显著低于对照;细胞学观察发现，基因敲除植株外稃表皮细胞明显小于对照。上述实验表明，OsGRF4可以通过控制细胞大小调控水稻籽粒粒长、粒宽及千粒重，OsGRF4即为调控307R籽粒粒型的主效基因GLW2。
　　2、亚细胞定位结果显示OsGRF4定位于细胞核;同时在酵母细胞中OsGRF4具有转录激活活性，其活性区域位于OsGRF4 C端，这与OsGRF4作为一个转录因子生化功能相符合。
　　3、分析发现GLW2含有与OsmiR396互补的序列，且大粒基因相对于小粒基因的突变位点刚好位于OsmiR396与OsGRF4的预测的结合区域。同时原位杂交显示，OsmiR396c和OsGRF4均在在颖壳中表达。对307R穗发育的不同时期的各个主要组织中GLW2表达量进行分析，相较于OsGRF4在日本晴中的表达模式，发现OsGRF4在日本晴穗发育过程中呈下降趋势，而在307R中呈上升趋势。OsmiR396c在日本晴穗发育过程中的表达模式刚好与OsGRF4互补，暗示OsGRF4的功能可能受OsmiR396c调控。
　　4、利用5‘-RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术，确定了OsmiR396c在日本晴幼穗中OsGRF4的剪切位点。在大粒材料307R中，OsmiR396c在该位点剪切效率只有正常材料的1/10左右。用不同背景的大粒基因近等基因系与一些不育系杂交，其F1代中存在OsGRF4正常与突变两种mRNA，通过对不同杂交组合F1代幼穗cDNA进行测序及峰图分析发现，正常OsGRF4 mRNA较大粒突变型mRNA出现了强烈的下调。该结果显示OsGRF4是OsmiR396的直接靶基因;OsGRF4与OsmiR396c结合位点两个碱基的突变降低了OsmiR396c的剪切效率，致使OsmiR396c对OsGRF4调控作用严重减弱，从而导致307R的大粒表型。
　　5、对OsmiR396c过表达发现，阳性植株籽粒粒长和千粒重均极显著低于对照;细胞学观察发现，过表达阳性植株外稃表皮细胞明显小于对照。在不改变编码氨基酸序列的条件下，通过定点突变OsGRF4的cDNA序列构建2个mOsGRF4过表达载体。转基因结果显示过表达抗OsmiR396c剪切的mOsGRF4阳性植株籽粒粒长、粒宽及千粒重均极显著高于对照;细胞学观察发现，过表达阳性植株外稃表皮细胞明显大于对照。上述结果表明OsmiR396c可以通过对OsGRF4的直接负调控影响水稻粒型粒重，而去除或抑制这一调控过程可以提高水稻粒重。
　　6、表达模式显示OsGIF1是一个组成型表达的基因，但其表达主要集中在茎和穗中。实验表明OsGIF1也定位于细胞核。利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术验证了OsGRF4和OsGIF1能发生直接相互作用。
　　7、以2x35S为启动子，对OsGIF1进行过量表达。结果显示，过表达阳性植株籽粒粒长、粒宽及千粒重均极显著高于对照;细胞学观察发现，过表达阳性植株外稃表皮细胞明显大于对照。
　　8、将近等基因系NIL-527R、NIL-MH63及对应亲本527R、MH63分别与不育系640A、106A进行杂交配制杂种F1。产量性状调查发现所有近等基因系组配后代株系的籽粒粒长、粒宽、千粒重和穗长极显著增加;其穗粒数和分蘖数无明显变化;所有近等基因系组配杂交稻单株产量和单位面积产量均显著增加，在不同亲本杂交后代中GLW2的增产潜力有差异，其增产幅度在13.74％-28.00％之间。
　　9、根据上述实验，我们明确了OsGRF4是控制水稻粒型粒重的关键基因，在该基因的上游，OsmiR396c可以对其进行直接调控，而在下游，OsGRF4通过与具有多效性的OsGIF1基因直接互作来调控水稻粒型粒重，我们的结果建立了一个新的水稻粒型粒重的调控途径，即OsmiR396c-OsGRF4-OsGIF1的调控通路。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 水稻粒型及产量调控基因的研究进展

1．1 水稻产量相关QTL

1．2 水稻粒型的分子调控机制

2 植物microRNAs在生长发育中的功能及研究进展

2．1 microRNA形成与作用机制

2．2 植物microRNAs的功能

3 GRFs(growth-regulating factors)和miR396研究进展

4 研究背景

5 研究目的与意义

第二章 实验材料与方法

1 实验材料

1．1 植物材料

1．2 重要试剂和溶液

1．3 重要实验器材

2 实验方法

2．1 水稻叶片总DNA的提取(SDS法)

2．2 总RNA提取

2．3 MicroRNA提取

2．4 农杆菌介导的水稻遗传转化

2．5 miRNA靶基因验证方法

2．6 酵母双杂交技术

2．7 双分子荧光互补技术

2．8 qRT-PCR

2．9 质粒小量提取

2．10 质粒大量提取

2．11 原位杂交流程

2．12 GUS染色

2．13 载体构建

第三章 实验结果

1 OsGRF4的功能分析

1．1 OsGRF4过量表达增加水稻籽粒大小与粒重

1．2 OsGRF4敲除后减小水稻籽粒大小与粒重

1．3 OsGRF4是一个具有活性的转录因子

2 OsGRF4是OsmiR396的靶基因

2．1 OsGRF4和OsmiR396的表达模式具有互补性

2．2 OsGRF4突变位点的产生降低了OsmiR396c的剪切效率

3 OsmiR396c的功能分析

3．1 OsmiR396c过表达能减小水稻籽粒大小

3．2 过表达OsmiR396c抗性靶基因m OsGRF4能增加水稻籽粒大小

4 OsGIF1能与OsGRF4直接互作

4．1 OsGIF1与OsGRF4有相似的表达模式

4．2 酵母双杂交

4．3 双分子荧光互补(BiFC)

5 OsGIF1功能分析

5．1 OsGIF1过量表达能增加水稻籽粒大小

6 GLW2产量潜力评估

7 水稻籽粒产量调控新途径：OsmiR396c-OsGRF4-OsGIF1通路

第四章 讨论

1 GLW2功能与育种应用

2 GRFs在籽粒发育中的作用

3 OsmiR396c-OsGRF4-OsGIF1调控模式的探讨

4 OsGIF1功能的多样性

5．OsmiR396c调控OsGRF4的唯一性?

6．展望

参考文献

致谢

发表论文情况

附录