鸭乙型肝炎病毒preS/S-C融合基因DNA疫苗的构建及其体液免疫应答的初步研究

摘要

鸭乙型肝炎病毒(Duck hepatisis B virus，DHBV)的基因组长约3kb，是由一条完整的负链和一条不完整的正链组成的不完全双链环状结构的DNA病毒，并且其正链与负链通过一段互补的重复序列连接。本试验首先通过PCR扩增和测序获得DHBV全长基因序列，然后使用真核表达质粒pVAX1构建DHBV preS/S-C融合基因DNA疫苗，并对其诱导鸭体液免疫效果进行初步研究。
　　1.鸭乙型肝炎病毒的全基因克隆与序列分析
　　本试验从四川省疑似感染DHBV的樱桃谷鸭体内分离到一株DHBV，命名为DHBV SCP01;然后通过PCR扩增、T克隆(pGM-T)与测序获得该病毒的全长基因序列，提交至NCBI，登录号为KM676220。基因结构分析发现，DHBV SCP01分离株的全长基因为3021 bp，包含3个开放阅读框(ORF)，即ORF-C、ORF-S与ORF-P，分别编码病毒的核心蛋白、表面蛋白与聚合酶蛋白，且均位于负链上。序列相似性分析发现，DHBV SCP01分离株与其它13株DHBV分离株的相似性介于89.47％～99.64％之间。其中，DHBV SCP01分离株与M32991分离株的相似性最低，仅为89.47％;与HQ214130(DHBV-XY)河南分离株的相似性最高，为99.64％。遗传进化分析和P蛋白标志氨基酸分析表明，DHBV SCP01分离株属于西方基因型。
　　2.DHBV preS基因的原核表达及其多克隆抗体的制备
　　运用生物信息学软件和在线预测工具对DHBVSCP01分离株的表面蛋白(preS/S蛋白)进行分析。结果表明，preS/S蛋白由328个氨基酸组成，分子量约为36.23 kDa;该蛋白有2个跨膜区，分别位于162-184 aa和235-257 aa，不存在信号肽序列;preS/S蛋白的抗原表位主要集中在前160个氨基酸区域。所以，本试验选择preS基因进行PCR扩增，构建原核表达质粒;然后将重组质粒转入Rosetta表达菌株中进行大量诱导表达与纯化，SDS-PAGE与Western blot分析;接着将重组preS蛋白免疫昆明雌鼠以制备多克隆抗体，间接ELISA检测鼠抗高免血清的抗体效价。结果表明，preS基因长度为483 bp，并成功构建原核表达质粒pET32a(+)-preS;在37C、0.6 mg/mL IPTG诱导4h时，重组preS蛋白的表达量最大，且该蛋白大小与预期相符合（重组preS蛋白理论值为38.6 kDa），为可溶性蛋白;多克隆抗体的效价为1∶25600。
　　3.DHBV preS/S-C融合基因DNA疫苗的构建及其表达
　　采用PCR扩增DHBV SCP01分离株的preS/S基因和C基因，融合PCR扩增preS/S-C基因，T克隆(pGEM-T);然后以pVAX1为载体，分别进行酶切连接，构建真核表达质粒pVAX1-preS/S、pVAX1-C和pVAX1-preS/S-C;接着转染COS7细胞，48 h后收集细胞样品。酶切鉴定以及测序分析表明，克隆的preS/S基因、C基因和preS/S-C基因长度分别为987 bp、789 bp和1818 bp，与NCBI上公布的DHBV SCP01分离株的preS/S基因和C基因序列相似性均为100％，表明成功构建了以上三种真核表达质粒。免疫印迹(Western blot)分析发现，细胞样品均在预期位置出现相应大小的条带(preS/S蛋白，36.2 kDa;C蛋白，30.3 kDa; preS/S-C蛋白，67.5 kDa)。
　　4.DHBV preS/S-C融合基因DNA疫苗的免疫原性研究
　　将20只1日龄的樱桃谷鸭随机平均分为5组，以300μg/只的免疫剂量将制备的DNA疫苗pVAX1（A组）、pVAX1-C（B组）、pVAX1-preS/S（C组）、pVAX1-preS/S+ pVAX1-C（D组）和pVAX1-preS/S-C（E组）分别经肌肉注射免疫4日龄雏鸭;在雏鸭14日龄时以300μg/只的免疫剂量对其进行第二次肌肉注射免疫。然后在首次免疫后2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d、21 d、28 d、35d、42 d、49 d、56 d分别对雏鸭进行静脉采血，间接ELISA检测免疫鸭血清中抗-preS和抗-C的抗体水平。结果表明，在首次免疫接种后21d，B组(1.5395±0.0599)、C组(1.5096±0.0452)、D组(1.4784±0.0462，1.4788±0.0571)和E组(1.6394±0.0462，1.6555±0.0421)的抗体水平均达到最高，均极显著(P＜0.001)高于A组(0.2569±0.0673，0.2750±0.0687);并且E组产生的抗体水平最高，显著高于B组、C组和D组(P＜0.05)，为后期DNA疫苗保护效果的研究提供一定的基础。

目录

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摘要

缩略词表

第一章 鸭乙型肝炎病毒DNA疫苗的研究进展

1．DNA疫苗的概述

2．DHBV表面抗原DNA疫苗的研究

2．1 表面抗原的功能研究

2．2 表面抗原基因疫苗的研究

3．DHBV核心抗原DNA疫苗的研究

3．1 核心抗原的功能研究

3．2 核心抗原基因疫苗的研究

4．融合基因DNA疫苗的研究现状

5．展望

6．研究目的及意义

第二章 鸭乙型肝炎病毒的全基因克隆与序列分析

1．试验材料

1．1 实验动物、毒株与菌种

1．2 主要试剂及其配制

1．3 主要仪器

2．试验方法

2．1 DNA提取

2．2 引物设计

2．3 PCR检测

2．4 DHBV的分离

2．5 DHBV全长基因的T克隆

2．6 DHBV全长基因的序列分析

3．结果

3．1 PCR检测血清中DHBV

3．2 DHBV全长基因的扩增、克隆与测序

3．3 DHBV全基因序列分析

4．讨论

5．小结

第三章 DHBV preS基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备

1．试验材料

1．1 毒株、菌种及实验动物

1．2 主要试剂及其配制

1．3 主要仪器

2．试验方法

2．1 DHBV preS／S基因的生物信息学分析

2．2 原核表达质粒pET32a(+)-preS的构建

2．3 原核表达质粒的诱导表达

2．4 重组蛋白表达条件的优化

2．5 重组蛋白的大量诱导表达与纯化

2．6 蛋白浓度的测定

2．7 鼠抗-preS高免血清的制备

3．结果

3．1 DHBV preS／S基因序列分析

3．2 DHBV preS基因的扩增

3．3 重组原核表达质粒的鉴定

3．4 重组preS蛋白的SDS-PAGE分析

3．5 重组preS蛋白的Western blot分析

3．6 重组preS蛋白的纯化

3．7 鼠抗-preS高免血清的效价检测

4．讨论

5．小结

第四章 DHBV preS／S-C融合基因DNA疫苗的构建及其表达

1．试验材料

1．1 毒株、菌种与细胞

1．2 主要试剂及其配制

1．3 主要仪器

2．试验方法

2．1 引物设计

2．2 目的基因的PCR扩增与回收

2．3 目的基因的T克隆

2．4 pVAX1-preS／S、pVAX1-C和pVAX1-preS／S-C的构建

2．5 转染

2．6 Western Blot检测重组质粒的表达产物

3．结果

3．1 preS／S、C与preS／S-C基因的PCR扩增

3．2 T克隆质粒的鉴定

3．3 真核表达质粒的鉴定

3．4 Western blot检测重组质粒的表达产物

4．讨论

5．小结

第五章 DHBV preS／S-C融合基因DNA疫苗的免疫原性研究

1．试验材料

1．1 实验动物、菌种与血清

1．2 主要试剂及其配制

1．3 主要仪器

2．试验方法

2．1 提取质粒

2．2 免疫动物

2．3 纯化抗原

2．4 抗原浓度测定

2．5 间接ELISA方法的建立

2．6 间接ELISA方法的应用

3．结果

3．1 重组C-SN蛋白的SDS-PAGE分析

3．2 间接ELISA的最佳工作条件和判定标准

3．3 间接ELISA检测鸭血清中抗preS蛋白的抗体

3．4 间接ELISA检测鸭血清中抗C蛋白的抗体

4．讨论

5．小结

参考文献

致谢

作者简介

攻读硕士学位期间完成的学术论文