齐口裂腹鱼GK基因时空表达及其影响初步研究

摘要

葡萄糖激酶(GK)是糖酵解过程中的限速酶，为了更好的了解齐口裂腹鱼GK的分子特点及调控作用，本研究运用RACE技术首次克隆了齐口裂腹鱼（Schizothoraxprenanti）的GK基因cDNA全序列;运用实时荧光定量PCR技术检测了GK基因在成鱼、产后亲鱼中的组织分布，测定了同一亲本的胚胎及胚后发育过程中GK基因表达时序;研究了不同开口饵料和灌服不同糖对齐口裂腹鱼GK基因表达的影响。
　　齐口裂腹鱼GK基因cDNA全序列共2087bp（GenBank登陆号:KT895594.1），其中5'-UTR为63bp，3'-UTR为593bp，ORF为1431bp，编码476个氨基酸，其中包括1个葡萄糖激酶特有结构域序列、ATP结合位点以及葡萄糖结合位点。齐口裂腹鱼GK的氨基酸序列与鲤鱼（Cyprinus carpio）、彭泽鲫（Carassius auratus var.Pengze）和草鱼（Ctenopharyngodon idella）的同源性分别高达到97.9％、97.3％和96.8％。
　　齐口裂腹鱼GK基因分布具有高度的组织特异性。成鱼的19个组织中，肝胰脏表达量最高，其次为心脏、卵巢和精巢，其余组织表达量很低。产后亲鱼16个组织中也是肝胰脏表达量最高（雌鱼高于雄鱼），但心脏、卵巢和精巢等其余组织表达量极低。繁殖过程对GK基因的组织分布有明显影响。
　　齐口裂腹鱼同一亲本子代的26个胚胎时期和10个胚后时期中，GK基因的表达时序特征分明，且胚后阶段的表达水平总体高于胚胎阶段。GK基因于未受精卵中有表达，至4细胞期(82.2℃·h)时差异不显著，8细胞期(104.7℃·h)时开始上调，到16细胞期(127.5℃·h)时达到最高，然后下降，到囊胚早期(225.3℃·h)其表达量与未受精卵相近，表达量再次上升并于原肠胚早期(684.7℃·h)之后下降，但于心脏原基出现(1619.2℃·h)时表达量出现小高峰，至出膜前期(2154.7℃·h)低于未受精卵表达水平。
　　GK基因表达水平在初孵仔鱼中较低，于循环期(4034.5℃·h)显著增加，到体色素出现期(4406.5℃·h)时又显著下降，此后表达量不断上调，到消化道贯通(6278.5℃·h)时最高，此时仔鱼平游觅食，能量消耗增加，而后GK又开始下调，于鳞片形成时仍高于未受精卵水平。GK基因高表达与胚胎、胚后发育过程中重要器官的形成和高能耗有关。本研究结果可为进一步研究GK基因在齐口裂腹鱼整个生命周期中的作用奠定基础。
　　蛋黄、卤虫卵、微粒饲料对齐口裂腹鱼仔鱼GK酶活力及基因表达的影响出现差异。3d时各饵料组的GK酶活力和基因表达量差异不显著，说明卵黄囊的存在会减小饵料对GK酶活力及基因表达的影响;3d至30d时卤虫卵组和微粒饲料组的GK基因表达量随养殖时间的增加不断提高，而蛋黄组GK基因表达量基本不变（除10d时略高）。仔鱼生长速度快，其GK基因表达量高，并随养殖时间增加而提高，但基因表达量与酶活力之间未反映出一致关系。
　　灌服葡萄糖和可溶性淀粉后1h时不会影响齐口裂腹鱼肝胰脏中GK的酶活力和基因表达量变化，1h后会诱导二者提高，24h时基本恢复灌服前水平，且葡萄糖效应时间更短，说明24h内鱼体对葡萄糖的糖酵解效率高于可溶性淀粉。灌服葡萄糖会抑制肝胰脏中PEPCK的酶活力和基因表达量，但不会抑制中肾、前肠和后肠中PEPCK基因的表达。本研究结果可为阐明齐口裂腹鱼糖代谢本质提供一定的理论依据。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1 文献综述

1．1 鱼类糖代谢概况

1．1．1 糖代谢主要途径

1．1．2 糖代谢主要场所

1．1．3 糖代谢能力

1．1．4 糖代谢关键酶

1．2 鱼类GK基因的研究进展

1．2．1 GK的发现与基因克隆

1．2．2 GK基因的分布

1．2．3 生物学功能与调控

1．2．4 糖类对鱼类GK、PEPCK的影响

1．2．5 小结

1．3 本研究的目的意义及研究内容

1．3．1 目的意义

1．3．2 研究内容

2 齐口裂腹鱼GK基因cDNA全长序列的克隆

2．1 试验材料

2．1．1 试验鱼

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 主要试剂配制

2．2 试验方法

2．2．1 组织采样

2．2．2 总RNA的提取及检测

2．2．3 制备cDNA

2．2．4 核心序列的克隆

2．2．5 RACE扩增

2．2．6 全长序列的拼接

2．2．7 生物信息学分析

2．3 试验结果

2．3．1 组织总RNA质量检测

2．3．2 GK基因的cDNA全序列

2．3．3 氨基酸序列分析

2．3．4 同源性和系统进化分析

2．4 讨论

3 齐口裂腹鱼GK基因的时空表达

3．1 试验材料

3．1．1 成鱼和产后亲鱼

3．1．2 胚胎

3．1．3 主要试剂

3．1．4 主要仪器

3．2 试验方法

3．2．1 组织取样

3．2．2 不同发育时期胚胎及仔鱼取样

3．3．3 总RNA提取及检测

3．2．4 制备cDNA模板

3．2．5 实时荧光定量PCR

3．2．6 数据分析

3．3 试验结果

3．3．1 引物质量检测结果

3．3．2 GK基因在齐口裂腹鱼成鱼、产后亲鱼中的组织分布

3．3．3 GK基因在齐口裂腹鱼胚胎及胚后发育过程中的表达情况

3．4 讨论

3．4．1 GK基因在齐口裂腹鱼成鱼、产后亲鱼中的组织特异性

3．4．2 GK基因在齐口裂腹鱼胚胎及胚后发育过程中的表达分析

4 不同开口饵料对齐口裂腹鱼GK酶活力及基因表达量的影响

4．1 试验材料

4．1．1 试验鱼

4．1．2 开口饵料

4．1．3 主要试剂

4．1．4 主要仪器

4．2 试验方法

4．2．1 饲养管理

4．2．2 试验分组及取样

4．2．3 指标测定

4．2．4 数据分析

4．3 试验结果

4．3．1 GK酶活力

4．3．2 GK基因表达量

4．4 讨论

4．4．1 不同开口饵料对仔鱼GK酶活力的影响

4．4．2 不同开口饵料对仔鱼GK基因表达量的影响

5 灌服葡萄糖和可溶性淀粉对GK、PEPCK酶活力及基因表达量的影响

5．1 试验材料

5．1．1 试验鱼

5．1．2 主要试剂

5．1．3 主要仪器

5．1．4 主要试剂配制

5．2 试验方法

5．2．1 饲养管理

5．2．2 试验分组及取样

5．2．3 指标测定

5．2．4 数据分析

5．3 试验结果

5．3．1 肝糖原

5．3．2 GK酶活力

5．3．3 PEPCK酶活力

5．3．4 GK基因表达量

5．3．5 PEPCK基因表达量

5．4 讨论

5．4．1 不同糖对齐口裂腹鱼肝糖原的影响

5．4．2 不同糖对齐口裂腹鱼GK、PEPCK酶活力的影响

5．4．3 不同糖对齐口裂腹鱼GK、PEPCK基因表达量的影响

6 主要结论

参考文献

致谢

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