肠道微生物与宿主免疫应答及其互作机制

摘要

作为机体的“第二器官”，微生物在宿主免疫调节中扮演着重要角色，但肠道微生物与宿主免疫应答的关系及作用机制仍不明确。本研究以猪和小鼠为动物模型，旨在探明肠道微生物与宿主免疫功能的关系及其可能互作机制，为深入认识肠道微生物与宿主健康的关系及研发动物肠道保健技术积累理论依据。
　　试验一 不同品种猪肠道微生物与免疫机能的差异及通过菌群移植对无菌小鼠的影响
　　本试验旨在比较约克猪和藏猪肠道微生物组成及部分免疫表型的差异，并考察菌群移植对无菌小鼠上的影响。试验选取健康的纯种约克猪和藏猪各5头，饲喂不含抗生素的相同饲粮56天后收集粪便用于检测菌群结构，并制备菌群悬液，-80℃保存用于菌群移植。取脾脏和大肠，称重并计算脾脏指数与大肠指数，同时取结肠样本用于细胞因子测定。而后选取健康状况良好16只1日龄无菌BALB/C小鼠随机分为2个处理(n=8)，分别接种约克猪和藏猪菌群悬液，并于28天后采集粪样，脾脏和大肠样本用于测定肠道菌群结构，脾脏指数，大肠指数和细胞因子。结果显示:
　　1.16S焦磷酸测序结果显示，约克猪与藏猪粪便微生物结构存在显著差异。其中约克猪粪便中拟杆菌门(Bacteroidetes)显著高于藏猪，而厚壁菌门(Firmicutes)显著低于藏猪;且该趋势可通过菌群移植传递给无菌小鼠。
　　2.藏猪脾脏体重比显著高于约克猪。且接受藏猪菌群的小鼠(TM)脾脏体重比显著高于接受约克猪菌群的小鼠(YM);
　　3.藏猪结肠组织中部分炎性细胞因子(TNF-α，IL-1，IL-6，IL-17)显著低于约克猪，同样，TM小鼠结肠中IL-6以及IL-17表达量显著低于YM小鼠。
　　以上结果表明，猪肠道微生物菌群结构具有品种特异性，且可携带宿主免疫特性在物种间传递。
　　试验二 早期肠道微生物干预对仔猪免疫应答的影响及其机制
　　为进一步弄清肠道微生物对宿主免疫应答的影响，本试验通过菌群移植构建了移植约克猪与藏猪的菌群仔猪模型，并通过灌服葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导急性肠炎以考察炎症状态下不同品种猪肠道微生物对仔猪获得性免疫的影响。试验选用30头3日龄DLY哺乳仔猪随机分为5个处理(n=6)，分别为对照组(CTL)，约克猪菌群移植组(Y-int)，藏猪菌群移植组(T-int)，约克猪菌群移植DSS处理组(Y-int-DSS)和藏猪菌群移植DSS处理组(T-int-DSS)。试验期56d。结果显示:
　　1.与对照比较，DSS处理成功诱导急性肠炎模型。
　　2.体重变化率、腹泻指数和血便指数综合表明T-int组仔猪对于DSS的抵抗能力显著高于Y-int组;形态学研究表明，相比约克猪微生物移植组，移植藏猪菌群以后DSS对肠道上皮组织损伤程度明显降低。
　　3.DSS处理Y-int组仔猪多种致炎性细胞因子水平显著上调，而对T-int组细胞因子水平未见显著影响。
　　4.DSS处理对T-int组IgA+B细胞数量、MAC387+巨噬细胞数量以及CD4+T细胞与CD8+T细胞比值没有明显影响，而Y-int组上述指标均显著上升。
　　本试验表明，新生仔猪移植藏猪肠道菌群可显著降低DSS诱导的肠炎及腹泻发生程度，其机制与菌群调节SCFAs、肠道免疫细胞以及PRR有关。
　　试验三 短链脂肪酸(SCFAs)对宿主免疫应答的调节作用及机制
　　在试验二基础上，本试验旨在进一步探索SCFAs对免疫应答的作用及其机制。①首先选用20只8周龄健康野生型C57BL/6小鼠分成4组，分别设为对照组，SCFAs处理组（乙酸与丁酸各500mM），抗生素(Abx)处理组（氨苄青霉素，庆大霉素，甲硝哒唑和万古霉素各1mg/ml）和SCFAs+Abx处理组，处理期28天。所有小鼠第0和第14天用卵清蛋白(OVA)进行免疫，并添加霍乱毒素(CT)作为佐剂。②再选用5只野生型C57BL/6小鼠和5只G蛋白偶联受体43(GPR43)基因敲除小鼠，同样饲喂SCFAs28天并用OVA/CT进行免疫，以研究GPR43在SCFAs诱导的特异性抗体中所扮演的角色。③从野生型小鼠脾脏中分离IgD+naive B细胞并采用SCFAs进行此外刺激以验证其对免疫球蛋白的诱导效应，并通过通过氢[3]同位素标记法验证SCFAs对T细胞增殖的影响。结果显示:
　　1.SCFAs显著提升野生型小鼠粪便和血清中抗原特异性(OVA/CTb-speicific)IgA，IgG（γ）水平。
　　2.抗生素处理大幅降低粪便和血液中特异性抗体水平，在抗生素处理后饲喂SCFAs，可一定程度提升免疫球蛋白水平。
　　3.GPR43-/-小鼠粪便中OVA特异性以及CTb特异性IgA与IgG水平均低于野生型小鼠，血清中抗原特异性IgG亦呈现出同样结果。
　　以上结果表明，SCFAs具有诱导抗原特异性免疫球蛋白和非特异性免疫球蛋白合成、促进T细胞增殖的功效，其机制与GPR43介导有关。
　　试验四 IL-33在宿主-肠道微生物对话中的作用及其机制
　　本试验通过系列体内外实验探明IL-33在宿主和微生物对话中的作用及可能机制。①首先采用高通量焦磷酸测序方法比较野生型小鼠和IL-33敲除小鼠粪便微生物结构差异。②然后比较野生型小鼠和IL-33-/-小鼠肠道上皮细胞(IEC)中REG3γ以及多种β防御素(β-defensins)表达水平，通过靶蛋白抑制剂、siRNA转染和CRISPR基因敲除技术探索IL-33在IEC上诱导REG3γ的信号通路。③再采用小鼠肠上皮细胞系(MSIE)验证了IL-33对REG3γ的体外诱导功效;采用REG3γ基因缺失的MSIE细胞系，提取总蛋白分别针对革兰氏阳性菌艰难梭菌（Clostridium difficile）和革兰氏阴性菌鼠柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium）进行了体外抑菌试验，以探明REG3γ在抑制病原菌中所发挥的作用。④最后采用DSS对野生型小鼠和IL-33-/-小鼠进行了急性结肠炎造模以考察IL-33在炎症中所扮演的角色。试验结果显示:
　　1.野生型小鼠与IL-33-/-小鼠肠道微生物结构存在显著差异，主要体现在毛螺菌属（Lachnospiraceae）和脱硫弧菌属（Desulfovibrio）上。相比野生型小鼠，IL-33-/-小鼠具有更高的总菌丰度，IL-33-/-小鼠对于C.rodentium的清除能力降低。
　　2.相比野生型小鼠，IL-33敲除小鼠肠道IEC中REG3γ含量显著降低，IL-33通过mTOR，STAT3和MEK-ERK通路诱导REG3γ的产生，且三种信号分子中，STAT3处于最下游并接受mTOR和ERK的调控。
　　3.IL-33可在体外诱导MSIE细胞产生REG3γ，但对β防御素无影响。在REG3γ存在的条件下，C.difficile和C.rodentium均表现出生长抑制。
　　4.相比野生型小鼠，IL-33-/-小鼠受DSS影响较小。
　　本研究首次发现肠上皮细胞分泌的IL-33可调节动物自身肠道菌群结构。机制上，IL-33通过“mTOR-STAT3”以及“MEK-ERK-STAT3”信号途径调节肠上皮细胞分泌REG3γ，后者对部分革兰氏阳性和阴性病原菌具有抑制作用。
　　试验五 IL-33在转化生长因子β存在的情况下抑制调节性T细胞的产生
　　试验四结果表明，IL-33缺失引起仔猪抗炎症能力增强，为探索其可能机制开展了本试验。①分别在结肠炎以及健康状况下考察了野生型小鼠和IL-33-/-小鼠肠道固有层淋巴细胞(LPL)以及肠上皮淋巴细胞(IEL)中调节T细胞(CD4+Foxp3+Treg)的含量。②从健康CBir1Flagellin-specific TCR转基因小鼠脾脏中分离Na(i)ve CD4+T细胞，考察不同浓度转化生长因子beta(TGF-β)对IL-33诱导CD4+Foxp3+Treg的效果的影响。结果显示:
　　1.在结肠炎或健康状态下，IL-33敲除后小鼠肠道固有层中调节T细胞(CD4+Foxp3+Treg)比例均显著提高。
　　2.在加入TGF-β阻断剂或不添加TGF-β情况下，IL-33可刺激Na(i)ve CD4+T细胞分化为Treg;然而当有TGF-β存在的情况下，IL-33则抑制Treg的分化。
　　3.IL-33受体ST2在Na(i)ve CD4+T细胞存在表达，且在无TGF-β情况下受IL-33正调控;而当有TGF-β存在情况下，IL-33则抑制ST2的表达。
　　本试验表明，内源性IL-33在炎症和健康状态下，由于TGF-β的存在，均对肠道中Treg细胞具有抑制作用，IL-33敲除小鼠呈现出更强抗炎特征的机制是CD4+Foxp3+Treg比例增加的结果。
　　综上表明，猪肠道微生物菌群结构具有品种特异性，且可携带宿主免疫特性在种间或品种间传递;肠道微生物通过PRR信号途径以及SCFAs-GPR43信号途径作用于肠粘膜，调节宿主细胞免疫和体液免疫，促进CD4+T细胞增殖，诱导抗原特异性免疫球蛋白和非特异性免疫球蛋白的合成，从而实现对肠粘膜的保护作用，降低应激条件下肠炎及腹泻发生程度;肠道分泌的IL-33通过mTOR-STAT3以及MEK-ERK-STAT3信号途径调节肠上皮细胞分泌REG3γ，从而调节动物自身肠道菌群结构;IL-33在TGF-β存在条件下对肠道中Treg细胞发挥抑制作用。本文初步揭示了肠道微生物-宿主免疫的作用方式及其机制。

目录

声明

摘要

缩写词表(Abbreviations)

前言

第一章文献综述

2．初生期的微生物定植及其意义

3肠道微生物对宿主免疫系统发育及功能的影响

3．1肠道微生物对肠道形态及肠道相关淋巴组织发育的影响

3．2肠道微生物与适应性细胞免疫

3．3肠道微生物与固有免疫

4．肠道微生物在炎性肠病中的角色

4．1共生微生物对炎性肠病的总体影响及其作用机制

4．2特定病原菌对炎性肠病的影响及其作用机制

4．3肠道微生物对炎性肠病的保护作用

5．微生物代谢产物短链脂肪酸调节宿主免疫系统

5．1短链脂肪酸的来源及其功能概述

5．2短链脂肪酸参与适应性细胞免疫调节

5．3肠道微生物通过短链脂肪酸调节免疫球蛋白的表达

6．宿主通过抗菌蛋白调节肠道微生物

6．1抗菌蛋白概述

6．2抗菌蛋白在体内的表达

6．3抗菌蛋白的作用机制

6．4抗菌蛋白在体内的表达调控

7．小结及展望

8．有待研究的问题

第二章本研究的目的，意义，主要内容和技术路线

3．技术路线

第三章实验研究

试验一 不同品种猪肠道微生物与免疫机能的差异及通过菌群移植对无菌小鼠的影响

1．材料与方法

2．结果与分析

3．讨论

4．小结

试验二 早期肠道微生物干预对仔猪免疫应答的影响及其机制

1．材料与方法

2．结果与分析

3．讨论

4．小结

试验三 短链脂肪酸(SCFAs)对宿主免疫应答的调节作用及机制

1．材料与方法

2．结果与分析

3．讨论

4．小结

试验四 IL-33在宿主-肠道微生物对话中的作用及其机制

1．材料与方法

2．结果与分析

3．讨论

4．小结

试验五 IL-33在转化生长因子β存在的情况下抑制调节性T细胞的产生

1．材料与方法

2．结果与分析

3．讨论

4．小结

第四章总体讨论，结论，创新点及有待进一步研究的问题

1．总体讨论

2．主要结论

3．创新点

4．有待进一步研究的问题

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录