柠条锦鸡儿植物抗旱基因的筛选及功能初步分析

摘要

沙生植物柠条锦鸡儿生长在半干旱、干旱地区，抗逆性极强。本研究以前期构建的柠条锦鸡几干旱处理前后的基因差异表达数据库为基础，通过生物信息学分析，获得抗旱候选基因，对部分候选基因进行了初步功能验证分析。主要结果如下:
　　(1)从生物信息学分析得到的49个差异上调表达基因中，随机挑选14个基因进行qRT-PCR检测，结果发现它们的表达趋势均与测序数据结果一致。这表明前期所获得的干旱胁迫差异上调表达基因是正确的。
　　(2)经过进一步的生物信息学分析，在49个差异上调表达基因中，只有22个基因具有完整ORF结构;利用所设计的特异引物进行PCR扩增，发现其中16个基因片段大小正确。
　　(3)对这16个候选目的基因进行克隆，构建表达载体，采用In-Fusion方法连接目的基因与载体，构建重组质粒并转入大肠杆菌。并通过冻融法将重组质粒转入到农杆菌感受态中，验证阳性克隆后通过蘸花法转化拟南芥。获得转基因拟南芥种子后，将16个候选基因的转基因株系通过正常条件下培养观察根长变化，结果发现第9号、13号、18号基因的转基因株系的根长同野生型相比较长。其中，9号基因的转基因株系的根长显著高于野生型。
　　(4)选择第9号基因的转基因株系进行进一步的干旱胁迫处理初步功能验证。对第9号基因的2个转基因株系分别进行了自然干旱处理和ABA、甘露醇、NaCl模拟干旱处理鉴定，发现第9号基因的转基因后代对各胁迫处理的抗性表现均优于野生型。对2个转基因株系的相关生理指标，包括叶片失水率、可溶性糖、叶绿素含量等进行检测，结果显示，与野生型相比，转基因植株抵御逆境胁迫的表现明显较强。这表明9号基因就是柠条锦鸡儿植物的重要抗旱基因之一。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1 文献综述

1．1植物抗旱机理

1．1．1渗透调节分子在作物干旱调控中的作用

1．1．2转录因子在植物干旱调控中的作用

1．1．3蛋白在植物抗旱中的作用

1．1．4植物抗旱的表型变化

1．2锦鸡儿属植物物种简介

1．2．1锦鸡儿属植物的分类与分布

1．2．2柠条锦鸡儿物种介绍

1．2．3柠条锦鸡儿植物的重要研究及利用价值

1．3柠条锦鸡儿植物抗旱性有关研究进展

1．3．1柠条锦鸡儿抗旱生理方面的研究

1．3．2柠条锦鸡儿抗旱性相关基因的研究

1．4本研究的研究内容和目的意义

2材料与方法

2．1实验材料

2．1．1植物材料

2．1．2实验仪器

2．1．3实验试剂

2．1．4质粒载体与菌株

2．2实验方法

2．2．1总RNA的提取

2．2．2反转录

2．2．3测序文库基因表达验证

2．2．4干旱上调表达基因基因结构的分析

2．2．5 PCR扩增

2．2．6 PCR扩增产物回收

2．2．7双酶切获得载体骨架

2．2．8用于同源重组基因片段的扩增

2．2．10大肠杆菌的转化

2．2．1 1转化农杆菌(EHAl05)

2．2．12拟南芥的培养

2．2．13拟南芥的遗传转化

2．2．14拟南芥转基因植株筛选

2．2．15转基因阳性植株分子检测

2．2．16正常生长条件下拟南芥转基因植株的表型鉴定

2．2．17自然干旱处理鉴定

2．2．18甘露醇处理鉴定

2．2．19 ABA处理鉴定

2．2．20 NaCI处理

2．2．21转基因植株叶片失水率鉴定

2．2．22叶片失水率、丙二醛，可溶性糖含量和叶绿素含量测定

2．2．23数据统计分析

3结果与分析

3．1测序文库差异上调表达基因的表达验证

3．2柠条锦鸡儿干旱上调表达基因的克隆

3．3构建表达载体及转化拟南芥

3．4转拟南芥T2代阳性植株筛选

3．5转基因拟南芥植株的表型鉴定

3．5．1正常生长条件下转基因植株的根长表型观察

3．5．2自然干旱处理下拟南芥转基因植株表型观察

3．6抗旱相关生理指标的比较

3．7甘露醇胁迫下转基因植株表型鉴定

3．8 ABA胁迫下转基因植株表型鉴定

3．9 NaCl胁迫条件下转基因植株表型鉴定

3．10基因的序列及表达分析

4讨论

4．1研究柠条锦鸡儿抗旱基因的意义

4．2柠条锦鸡儿抗旱基因的筛选与克隆

4．3柠条锦鸡儿9号抗旱基因的功能

5结论

参考文献

致谢

作者简历