鸭胚胎期腿肌发育不同阶段差异表达基因和miRNAs的筛选与功能验证

摘要

腿肌和胸肌是水禽骨骼肌的重要组成部分，两者在肌纤维类型、发育规律等方面存在显著差异。前人的研究主要集中于胸肌的发育特征及其调控机制方面，腿肌发育的分子机理研究报道较少。因此，本研究以发育不同时期樱桃谷肉鸭胚胎期腿肌为研究材料，首先，从组织学和基因表达水平解析胚胎期腿肌发育规律;其次，利用RNA-seq和miRNA-seq技术筛选鸭胚胎期腿肌发育不同时期的差异表达基因、差异表达miRNAs以及调控的差异信号通路;再次，从细胞水平探讨在发育不同时期均存在显著差异的miR-33a调控鸭成肌细胞增殖的的分子机制;最后，从细胞水平探讨卵泡抑素(Follistatin，FST)调控鸭成肌细胞增殖的分子机制。研究结果如下:
　　(1)鸭胚胎期腿肌发育过程主要分为成肌细胞增殖期、肌管期和肌纤维期，且三个时期对应的关键发育时间点:11胚龄(E11)、19胚龄(E19)和27胚龄(E27)。
　　(2)RNA-seq结果的分析表明，E11与E19相比存在1182个显著差异表达的基因(DEGs)（FDR≤0.01），875个上调，307个下调;E19与E27相比存在1967个DEGs（FDR≤0.01），1052个上调，915个下调;E11与E27相比存在1484个DEGs（FDR≤0.01），654个上调，830个下调。研究发现从肌管发育成肌纤维阶段的差异基因数多于成肌细胞发育成肌管阶段。
　　(3)miRNA-seq结果的分析表明，E11与E19相比存在194个显著差异表达的已知miRNAs（FDR≤0.01），105个调，89个下调;E19与E27相比存在550个显著差异表达的已知miRNAs（FDR≤0.01），156个上调，394个下调;E11与E27相比存在369个显著差异表达的已知miRNAs（FDR≤0.01），143个上调，226个下调。研究发现从肌管发育成肌纤维阶段的差异miRNAs数多于成肌细胞发育成肌管阶段。
　　(4)miRNA-seq结果预测出新miRNAs在发育的不同时期差异如下:E11与E19相比存在7个显著差异表达的新miRNAs（FDR≤0.01），5个上调，2个下调;E19与E27相比存在25个显著差异表达的新miRNAs（FDR≤0.01），3个上调，22个下调;E11与E27相比存在9个显著差异表达的新miRNAs（FDR≤0.01），2个上调，7个下调。研究发现肌管发育成肌纤维阶段比成肌细胞发育成肌管阶段存在更多的差异新miRNAs，差异新miRNAs在肌管发育成肌纤维的过程中发挥重要的调控作用。
　　(5)RNA-seq和miRNA-seq的KEGG分析表明，p53信号通路、MAPK信号通路、细胞周期信号通路上富集的差异基因丰度较高;采用荧光定量PCR方法验证了p53信号通路上Zinc finger protein RFP-like1、DNAJC6、ZSWIM2、CDKL2、CDK14、CCNB3、RRM2、CCNB2、Cytochrome c-like共9个基因的mRNA水平的表达量，表达趋势与转录组测序结果一致。该研究暗示此三个信号通路可能是调控鸭胚胎期腿肌发育差异的重要信号通路。
　　(6)miRNA-seq结果的分析表明miR-33a的表达在腿肌发育的三个时期间存在显著差异，miR-33a的表达量在鸭成肌细胞增殖期显著高于其余两个时期;在成肌细胞中过表达miR-33a后、能通过靶向抑制IGF-1、FST和CCND1，并抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路来抑制鸭成肌细胞增殖。
　　(7)过表达FST基因的结果表明，FST过表达能增强成肌细胞活性和促进成肌细胞增殖，FST过表达促进鸭成肌细胞增殖的机制主要通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路来实现。
　　综上所述，本研究从组织和细胞水平探讨了鸭胚胎期腿肌发育不同时期在基因表达和miRNAs表达上的差异，并对影响鸭胚胎期腿肌发育的关键miRNAs、调控基因及调控的信号通路进行了功能研究，为系统全面的阐述骨骼肌发育的分子机制奠定理论基础。

目录

声明

摘要

常用英文缩写词汇

第一章文献综述

1．1骨骼肌的发育

1．1．1胚胎期骨骼肌发育

1．1．2出生后骨骼肌发育

1．2调控骨骼肌发育的分子机制

1．2．1调控骨骼肌发育的相关基因

1．2．2调控骨骼肌发育的相关miRNAs

1．2．3禽类骨骼肌发育相关miRNAs研究现状

1．2．4调控骨骼肌发育相关的信号通路

1．3 RNA-seq和miRNA-seq技术在畜禽研究中的应用

1．3．2 miRNA-seq技术在畜禽研究中的应用

1．4本研究目的意义、内容与技术路线

1．4．1研究目的与意义

1．4．2研究内容

1．4．3技术路线

第二章鸭胚胎期腿肌发育特征研究

2．1引言

2．2材料与方法

2．2．1试验试剂

2．2．2主要仪器

2．2．3常用的分析软件

2．2．4测定指标与方法

2．3结果与分析

2．3．1鸭胚胎发育过程中腿肌的重量变化分析

2．3．2鸭胚胎发育过程中腿肌的形态变化分析

2．3．3鸭胚胎期腿肌发育过程中MRFs家族主要基因的mRNA表达模式

2．4讨论

2．5小结

第三章鸭胚胎期腿肌发育不同阶段的调控机制研究

3．1引言

3．2材料和方法

3．2．1试验动物

3．2．2主要试验试剂及仪器

3．2．3常用生物学软件及数据库

3．2．4 RNA-seq试验流程

3．2．5 miRNA-seq试验流程

3．3结果与分析

3．3．1 RNA-seq结果及生物学功能分析

3．3．2 miRNA-seq结果及生物学功能分析

3．4讨论

3．4．2调控鸭胚胎期腿肌发育的主要信号通路

3．5小结

第四章miR-33a调控鸭成肌细胞增殖的机制研究

4．1引言

4．2材料与方法

4．2．1试验材料

4．2．2试剂和仪器

4．2．3试验步骤

4．3结果与分析

4．3．1过表达miR-33a和干扰miR-33a的效率鉴定

4．3．2过表达miR-33a和干扰miR-33a对鸭成肌细胞活性与增殖的影响

4．3．3 miR-33a对IGF-1，FST和CCND1的调控影响

4．3．4 miR-33a在调控成肌细胞增殖过程中对PI3K／Akt／mTOR通路的影响

4．4讨论

4．5小结

第五章鸭卵泡抑素调控成肌细胞增殖的机制研究

5．1引言

5．2材料与方法

5．2．1试验材料

5．2．2主要试剂与仪器

5．2．3试验步骤

5．3结果与分析

5．3．1过表达FST对鸭成肌细胞增殖的影响

5．3．2过表达FST对PI3K／Akt／mTOR通路上相关基因表达的影响

5．3．3添加LY294002抑制剂和过表达FST对成肌细胞增殖的影响

5．3．4添加LY294002抑制剂和过表达FST对PI3K／Akt／mTOR通路的影响

5．3．5添加Rapamycin抑制剂和过表达FST对成肌细胞增殖的影响

5．3．6添加Rapamycin抑制剂和过表达FST对PI3K／Akt／mTOR通路的影响

5．4讨论

5．5小结

第六章总结

6．2本研究的创新之处

6．3还需要完善和解决的问题

参考文献

致谢

附录

作者简历