湖羊、杜泊羊×湖羊F1代骨骼肌差异表达基因和miRNA的筛选与验证

摘要

湖羊是我国特有的珍贵绵羊品种，由于长期以羔皮的质量和繁殖性能为目标进行定向选育，导致湖羊前期生长虽快，但肉用性能较低。因此，深入研究绵羊骨骼肌生长发育的分子机理，阐明miRNA及其靶基因在肌肉生长速度、品质性状形成过程中的调控机制，开展纯种湖羊与杜泊×湖羊F1代骨骼肌中差异表达miRNA和基因的筛选及表达调控研究将为湖羊产肉性状的分子改良提供新的思路，也为肉用湖羊新品系的选育奠定理论基础。　　本试验选取6月龄纯种湖羊、杜泊×湖羊F1代各8头（公母各半），利用基因芯片和高通量测序技术筛选出纯种湖羊与杜泊×湖羊F1代BFM、LDM、PMM样品间的差异表达基因和miRNA，同时对这些差异表达基因和miRNA进行了功能注释及KEGG通路分析，并选取血管平滑肌收缩信号通路作为研究对象，确定纯种湖羊、杜泊×湖羊F1代品种间及不同组织间该通路内基因的表达情况。此外，还发现了绵羊ACTG2基因5'UTR区域的两种可变剪接，并对通路内与骨骼肌发育密切相关的差异表达基因MYL3及ACTG2的两种剪接形式进行了定量分析。研究结果如下:　　(1) miRNA测序及荧光定量验证实验结果:　　对纯种湖羊和杜泊×湖羊F1代BFM、LDM、PMM样品的miRNA测序结果显示:在纯种湖羊和杜泊×湖羊F1代BFM的比较中，2倍上调和下调的差异表达miRNA分别有4个(Novel-58、Novel-49b*、miR-628、miR-2285k*)和3个(miR-744、miR-708、Novel-13b);在PMM的比较中，分别有26个和44个;在LDM的比较中，分别有3个(oar-miR-299-5p、Novel-13b、Novel-25)和2个(Novel-11、oar-miR-409-5p)。在纯种湖羊BFM和LDM的比较中，2倍上调和下调的差异表达miRNA分别有35个和40个;在BFM和PMM的比较中，分别有25个和31个;在PMM和LDM的比较中分别有19个和14个。在杜泊×湖羊F1代BFM和LDM的比较中，2倍上调和下调的差异表达miRNA分别有55个和58个;在BFM和PMM的比较中，分别有29个和45个;在PMM和LDM的比较中，分别有15个和12个。　　本研究成功建立了茎-环RT-PCR法结合实时荧光定量PCR检测绵羊miRNA的表达体系。利用该体系对差异表达miRNA进行定量，结果显示6月龄雄性湖羊LDM中oar-miR-299-5p的表达量极显著高于6月龄雄性杜泊×湖羊F1代(P＜0.01)，与miRNA测序的结果一致。　　(2)基因芯片检测及荧光定量验证实验结果:　　纯种湖羊和杜泊×湖羊F1代BFM、LDM、PMM样品的全基因组表达谱芯片结果显示:在纯种湖羊和杜泊×湖羊F1代BFM样品的比较中，2倍上调和下调的差异表达基因分别有11个和40个;在PMM样品的比较中，分别有31个和28个;在LDM样品的比较中，分别有50个和34个。在纯种湖羊BFM和LDM样品的比较中，2倍上调和下调的差异表达基因分别有24个和15个;在BFM和PMM样品的比较中，分别有13个和12个;在PMM和LDM样品的比较中，分别有1个和5个。在杜泊×湖羊F1代BFM和LDM样品的比较中，2倍上调和下调的差异表达基因分别有16个和15个;在BFM和PMM样品的比较中，分别有44个和11个;在PMM和LDM样品的比较中，分别有7个和32个。　　对纯种湖羊和社泊×湖羊F1代BFM、LDM、PMM样品中2倍上调和下调的差异表达基因进行GO分类，这些差异表达基因参与了组织发育、细胞增殖、骨骼肌细肌丝组装等多种生物学过程。　　对纯种湖羊和杜泊×湖羊F1代BFM、LDM、PMM样品中2倍上调和下调的差异表达基因进行KEGG通路分析，并选取血管平滑肌收缩信号通路做进一步分析发现，该通路中2倍上调或下调的差异表达基因包括ACTG2、MYL3、ACTN2、蛋白赖氨酸甲基转移酶基因、γ-胞浆钙独立磷脂酶A2基因和Similar to RIKEN cDNA共6个基因，涉及肌球蛋白轻链激酶活性、钙调素依赖蛋白激酶活性、细胞骨架的结构成分等7种分子功能;参与肌动蛋白细胞骨架、平滑肌收缩纤维、横纹肌细肌丝等10种分子组成;还参与骨骼肌细肌丝的装配、血管平滑肌收缩、细胞凋亡等18个生物学过程。　　本试验选取血管平滑肌收缩信号通路中差异表达的ACTG2基因进行序列分析，从纯种湖羊、杜泊×湖羊F1代转录模板中扩增得到长度分别为1317 bp和1299 bp的两种ACTG2基因序列，两个序列的区别在于ACTG2基因的5'UTR存在65 bp和83 bp的可变剪接。且检测得到的两种剪接形式与NCBI上登录的5'UTR长度为116 bp的标准序列(XM_004006081)皆不一致。所以，本试验首次发现了绵羊ACTG2基因5' UTR长度为65 bp和83 bp的两种可变剪接。　　对MYL3基因、ACTG2基因及ACTG2基因5'UTR区长度为83bp的剪接形式的定量分析发现，MYL3基因在纯种湖羊总体及雄性纯种湖羊BFM样品中的表达量均显著高于LDM样品(P＜0.05)，在雌性纯种湖羊BFM样品中的表达量虽高于LDM样品，但差异并不显著;MYL3基因在杜泊×湖羊F1代BFM样品中的表达量皆极显著高于LDM样品(P＜0.01)。MYL3基因在纯种湖羊BFM样品中的表达量显著高于杜泊×湖羊F1代BFM样品(P＜0.05)。ACTG2基因的总表达量在纯种湖羊、杜泊×湖羊F1代品种间及组织间的表达差异不显著。5'UTR区长度为83 bp剪接形式的ACTG2基因在雌性杜泊×湖羊F1代LDM样品中的表达量显著高于BFM样品(P＜0.05)。在雄性纯种湖羊BFM样品中的表达量显著高于雄性杜泊×湖羊F1代BFM样品(P＜0.05)，且该种剪接形式在总的ACTG2基因的表达量所占的比例也极显著地高于杜泊×湖羊F1代（P＜0.01）。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩写说明

第一章 文献综述

1．1 骨骼肌生长发育研究进展

1．1．1 骨骼肌的形成及发育

1．1．2 影响骨骼肌发育的因素

1．1．3 基因芯片在骨骼肌生长发育研究中的应用

1．2 microRNA研究进展

1．2．1 miRNA的生物学特性及形成

1．2．2 miRNA与靶基因的作用机理

1．2．3 miRNA在骨骼肌发育过程中的作用及研究进展

1．2．4 高通量测序在microRNA研究中的应用

第二章 湖羊、杜泊×湖羊F1代肌肉组织差异表达miRNA筛选与分析

2．1 试验动物与样品采集

2．2 主要仪器与试剂

2．2．1 主要仪器设备

2．2．2 主要试剂

2．2．3 相关试剂配制

2．3 试验方法

2．3．1 肌肉样品总RNA的提取及质检

2．3．2 miRNA测序

2．3．3 定量PCR验证及数据分析

2．4 结果与分析

2．4．1 总RNA质检结果

2．4．2 文库的混合方案及质控

2．4．3 测序结果

2．4．4 miR-1、miR-133和oar-miR-299-5p的定量PCR验证

2．5 讨论

2．5．1 MicroRNA及其研究方法

2．5．2 湖羊、杜泊×湖羊F1代2倍差异表达miRNA及定量结果讨论

2．5．3 茎-环RT-PCR法定量检测绵羊3种miRNA的表达体系的建立

第三章 湖羊、杜泊×湖羊F1代肌肉组织总RNA芯片检测及分析

3．1 试验动物与样品采集

3．2 主要仪器与试剂

3．2．1 主要仪器

3．2．2 主要试剂

3．2．3 相关试剂配制

3．3 实验方法

3．3．1 肌肉样品总RNA的提取及质检

3．3．2 芯片检测

3．3．3 差异表达基因的序列分析

3．3．4 实时荧光定量PCR验证差异表达基因

3．4 结果与分析

3．4．1 总RNA的质检结果

3．4．2 总RNA的混池方案及质控

3．4．3 芯片检测结果

3．4．4 湖羊及杜泊×湖羊F1代羊ACTG2基因的克隆与分析

3．4．5 ACTG2和MYL3基因的定量PCR验证

3．5 讨论

3．5．1 基因芯片的选择

3．5．2 信号通路中差异表达基因的定量及影响肌肉发育的因素分析

第四章 结论

创新点

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文