基于染色体原位杂交的中国樱桃核型分析及其基因组构成的初步探究

摘要

中国樱桃(Cerasus pseudocerasus(Lindl.)G.Don)，为多年生木本植物，为蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)樱属(Cerasus)。中国樱桃花朵靓丽，树姿优美;果实色泽饱满，香味浓郁，结果率高;根系发达，亲和力强，可作为优良砧木;适应性广，遗传多样性丰富，可为育种提供丰富来源，深受青睐，引起广泛关注。
　　目前，中国樱桃种质资源在表型性状、细胞学、分子标记方面均有研究。其中，细胞学方面最备受争议。在前人研究中，多数采用传统核型手段来研究中国樱桃种质资源的核型分析及进化趋势，且结果不一。目前，中国樱桃的分子细胞学研究仍为空白。因此，本研究以15份中国樱桃种质资源为研究对象，采取压片法和滴片法进行染色体制片，确定中国樱桃的染色体数目、倍性;为进一步精确核型，采取间接和直接两种标记探针方法，摸索建立中国樱桃染色体原位杂交体系;建立rDNA-FISH体系，初步探究45S rDNA和5SrDNA在中国樱桃染色体上的分布模式;以近缘物种为探针，建立基因组原位杂交体系，初步判断中国樱桃与华中樱桃C.conradinae、钟花樱桃C.campanulata(2n=2x=16)、日晚晚樱C.serrulata vat.lannesiana(2n=2x=16)、欧洲甜樱桃C.avium(2n=2x=16)的亲缘关系。主要研究结果如下:
　　1、中期染色体制片方法
　　压片法、滴片法均适合中国樱桃染色体制片。综合考虑，中国樱桃核型分析采用压片法;采用滴片法制片进行染色体原位杂交。
　　2、中国樱桃染色体数目和核型分析
　　供试材料中发现中国樱桃种质资源中主要为四倍体(2n=4x=32)，存在五倍体(2n=5x=40)和六倍体(2n=6x=48)。其中，有且只有四川荥经栽培品种为五倍体，陕西风县种质是唯一发现的六倍体，未发现二倍体、三倍体。
　　中国樱桃的核型属于1A类型;主要核型公式是2n=4x=32=32m，其次，2n=4x=32=28m+4sm;存在五倍体核型为2n=5x=40=40m;六倍体核型为2n=6x=48=48m。就所有供试材料发现，平均臂比值在1.1-2.7之间;染色体长度比在1.28-2.17之间;中国樱桃的染色体相对长度构成类型广而集中，主要由M2、M1构成，也存在少量的S染色体。
　　3、染色体原位杂交体系
　　采用直接和间接两种标记探针法，筛选出中国樱桃的染色体原位杂交直接标记体系，探针适宜浓度在1000ng/μL左右，杂交时间为16-18h。
　　4、rDNA位点在中国樱桃染色体上的分布
　　以rDNA为探针，与中国樱桃染色体进行荧光原位杂交。结果表明，中国樱桃染色体具有8个5S rDNA位点，其中4个信号较强，位于短臂近着丝粒区，4个较弱，位于染色体短臂端部。在中国樱桃染色体上检测到6个45S rDNA位点，位于染色体端部的2个信号较强，位于短臂近着丝粒区的2个信号和位于次缢痕区的2个信号较弱。
　　5、基因组DNA在中国樱桃染色体上的分布
　　以中国樱桃及其樱属近缘种基因组DNA为探针，与中国樱桃染色体进行基因组原位杂交。结果表明，自身基因组DNA为探针的杂交信号分布在中国樱桃的每条染色体上，信号强，主要集中在染色体近端部和近着丝粒区。以华中樱桃和钟花樱桃基因组DNA为探针，在32条染色体上检测到较强信号，分散在每条染色体上。以日本晚樱基因组DNA为探针，在32条染色体上检测到较弱信号，主要分布在染色体短臂近端部和近着丝粒区。欧洲甜樱桃基因组DNA信号零星出现染色体上，信号强度最弱。据此推测，华中樱桃/钟花樱桃与中国樱桃的亲缘关系最近，日本晚樱次之，欧洲甜樱桃最远。其中，同为樱亚属细齿组的华中樱桃和钟花樱桃分别与中国樱桃的基因组原位杂交信号相似，无法判断。

目录

声明

摘要

1前言

1．1植物种质资源

1．2植物多倍体的分类

1．3植物种质资源的细胞学研究

1．3．1染色体核型在植物种质资源中的应用

1．3．2染色体显带技术在植物种质资源中的应用

1．3．3染色体原位杂交技术在植物种质资源中的应用

1．4中国樱桃种质资源细胞学研究现状

1．4．1樱属的系统分类

1．4．2中国樱桃的分布

1．4．3中国樱桃染色体核型研究现状

1．5本研究的目的意义

2材料与方法

2．1技术路线

2．2试验材料

2．3染色体数目和核型分析

2．3．1根尖的培养及保存

2．3．2中期染色体的制备

2．3．3染色体核型分析

2．4染色体原位杂交

2．4．1基因组DNA提取

2．4．2 rDNA探针制备

2．4．3直接标记法

2．4．4间接标记法

3结果与分析

3．1中期染色体制备

3．1．1压片法

3．1．2滴片法

3．2中国樱桃地方种质资源核型

3．2．1中国樱桃地方种质资源的核型结果

3．2．2中国樱桃地方种质资源的核型比较

3．3中国樱桃染色体原位杂交

3．3．1探针制备

3．3．2染色体原位杂交间接标记结果

3．3．3染色体原位杂交直接标记结果

3．3．4染色体原位杂交标记方法的比较

3．3．5中国樱桃的rDNA荧光原位杂交结果

3．3．6中国樱桃与近缘种的基因组原位杂交结果

4讨论

4．1染色体制片方法的比较

4．2核型分析

4．3染色体原位杂交结果分析

4．3．1 rDNA位点在中国樱桃染色体上的分布

4．3．2基因组DNA在中国樱桃染色体上的分布

5小结与展望

参考文献

致谢