矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因(AnVP1)的异源表达提高玉米耐旱性

摘要

干旱制约着玉米的生产及发展，严重影响玉米生长发育及籽粒产量。传统育种方法选育耐旱品种周期长、效率低，更由于玉米自身耐旱种质资源狭窄，难以选育成能满足生产需求的耐旱品种。因此，挖掘具有自主知识产权的抗旱抗逆基因是玉米抗逆转基因研究的必须之路。转基因技术可克服物种间的生殖障碍，转化利用其他物种的耐旱基因，是克服干旱威胁最为经济有效的措施。
　　在前期研究中，课题组从残遗超旱生植物矮沙冬青中，克隆了液泡膜氢离子焦磷酸酶基因(AnVP1)，转化酵母和拟南芥突变体验证其对非生物逆境的抗性后，用农杆菌介导法转化玉米自交系，共获得47个T1代转基因株系。
　　本研究对AnVP1基因推导蛋白进行安全性预测后，结合除草剂抗性筛选、特异PCR扩增、高效热不对称交错式PCR(High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR，hiTAIL-PCR)、反转录PCR(Reverse-transcription PCR，RT-PCR)和RNA测序(RNA-sequencing，RNA-seq)、盆栽和田间耐旱性鉴定等方法，对这47个转基因株系进行了繁育和鉴定，主要结果如下:
　　(1)数据库比对结果，AnVP1基因推导蛋白与所有已知毒蛋白、过敏原和抗营养因子均不同源，说明我们克隆的AnVP1基因是安全的，可用于转化玉米等作物。
　　(2)在自交繁育的同时，结合田间抗除草剂筛选和特异PCR鉴定，繁育获得26个T3代株系，其中12个株系在T2代的阳性率即达100％，表明这12个T3代株系已经纯合，可用于后续抗性鉴定
　　(3)用hiTAIL-PCR扩增出A1、A16和A49三个T2代株系T-DNA整合位点右边界的侧翼序列，将这三个株系T-DNA整合位点分别定位于第5、6和6号染色体，并且发现A31、A33和A37三个株系T-DNA的整合携带了部分表达载体骨架。
　　(4)用RT-PCR方法可从12个纯合的T3代株系中均检测到AnVP1基因的表达，表明AnVP1基因不仅整合进玉米基因组，也在玉米中异源表达。
　　(5)在T2和T3代株系反复多次的盆栽试验中，标记为A31、A33和A37的三个株系的幼苗在干旱胁迫15d后复水，能全部恢复生长，耐旱性显著高于未转基因对照，而其余株系只有部分恢复生长，与未转基因对照差异不明显。
　　(6)RNA-seq分析表明，A31、A33和A37株系分别有285、169和288内源基因较未转基因对照差异表达。其中，上调表达的分别有149、92和115个，下调表达的分别有136、77和173个基因，在3个转基因株系中共同上调和下调表达的分别有6和12个。GO分析表明，在差异表达基因中，分子功能相关基因有326个，涉及催化活性、结合和转录调控等代谢途径，归分为12个种类;细胞组分相关基因有115个，涉及细胞和细胞器成分等，归分为11个类型;生物学过程相关基因有245个，涉及代谢过程、细胞进程、应激反应、生物调节和发育过程等，分为17类。由此说明，T-DNA的整合还可能通过对内源基因表达的影响间接调控胁迫应答、糖代谢及生长发育。
　　(7)田间试验表明，转基因株系A765的单株粒重及其在干旱胁迫条件下的耐旱系数均显著高于未转基因对照和优良自交系郑58，转基因株系A737在非胁迫条件下的单株粒重也显著高于未转基因对照。
　　上述结果表明，矮沙冬青AnVP1基因已整合到玉米基因组中，其异源表达提高了转基因株系的耐旱性。经进一步筛选繁育、表型鉴定和安全性评价后，所获转基因株系有望应用于耐旱玉米品种培育。

目录

声明

摘要

1文献综述

1．1 干旱对玉米生产的影响

1．2 转基因耐旱玉米

1．3 液泡膜氢离子焦磷酸酶基因

1．3．1 氢离子焦磷酸酶

1．3．2 氢离子焦磷酸酶的功能

1．3．3 液泡膜氢离子焦磷基因

1．3．4 V-H+-PPase基因在植物中的遗传转化

1．4．1 矮沙冬青

1．4．2 矮沙冬青的抗逆性

1．4．3 矮沙冬青抗逆相关基因

1．4．4 矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因

1．5 外源基因整合位点的精确定位

1．5．1 TAIL-PCR

1．5．2 高效TAIL-PCR

1．6．1 T-DNA

1．6．2 T-DNA的整合特征

1．7 外源基因的安全性评价

1．8 本研究的目的意义

1．9 技术路线

2材料和方法

2．2．2 基因组DNA提取

2．2．3 特异PCR检测

2．3 T3代株系T-DNA整合位点分析

2．3．1 hiTAIL-PCR扩增

2．3．2 连接pMD19-T载体与转化

2．3．3 T-DNA整合位点侧翼序列分析

2．4 T3代株系的RT-PCR检测

2．4．1 总RNA提取

2．4．2 基因组DNA去除和反转录合成cDNA

2．4．3 RT-PCR检测

2．5．1 T2代株系的田间鉴定

2．5．2 T2代株系的盆栽鉴定

2．6 转基因株系的RNA测序

2．6．1 RNA测序

2．6．2 基因表达差异分析

3结果与分析

3．1．2 与已知过敏原没有同源性

3．1．3 与已知抗营养因子没有同源性

3．2．1 T1代株系筛选繁育

3．2．2 T2代株系繁育与检测

3．3 转基因株系T-DNA整合位点

3．3．2 T-DNA整合位点

3．3．3 T-DNA侧翼序列与表达载体的同源性

3．4 AnVP1基因的异源表达

3．5 转基因株系的耐旱性

3．5．1 T2代株系的田间耐旱性

3．5．2 T3代株系盆栽耐旱性

3．6 转基因株系内源基因的差异表达

3．6．1 RNA样品质量

3．6．2 RNA测序质量

3．6．3 基因差异表达分析

4讨论

参考文献

致谢