核苷酸对生长中期草鱼生产性能、功能器官健康及肌肉品质的作用及机制

摘要

本试验选取初重为200.0±1.0g的健康草鱼（540尾），随机分为6个处理（3个重复），饲喂添加水平为（0.0、200.0、400.0、600.0、800.0和1000.0mg/kg）的核苷酸日粮进行为期60d的生长试验，考察核苷酸对生长中期草鱼生产性能、肠道微生物和肌肉品质的作用。生长试验结束后各处理选取15尾鱼进行嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌攻毒试验，研究核苷酸对草鱼功能器官（肠道、头肾、脾脏、皮肤和鳃）结构完整性和免疫功能的影响及其作用机制。并根据不同的标识确定了核苷酸的最适宜添加量。
　　研究发现:和对照组相比，适宜添加水平的核苷酸显著提高了生长中期草鱼增重百分比、特定生长率、采食量和饲料效率(P＜0.05)，同时提高了肠重(IW)和肠长(IL)，表明核苷酸对草鱼具有促生长作用。核苷酸增加了乳酸杆菌、芽孢杆菌和双歧杆菌数量，降低了大肠杆菌和嗜水气单胞菌数量。核苷酸减少草鱼肠炎、赤皮和烂鳃发生，这与其提高了功能器官的结构完整性和免疫功能有关。一方面，适宜水平的核苷酸通过下调Kelch绑定蛋白1[Keap1a（前肠、中肠、后肠除外）和Keap1b]，上调核转录因子(Nrf2)促进CuZnSOD、MnSOD、CAT、GPx（1a、1b、4a和4b）、GST[GSTR、GSTO1、GSTO2、GSTP1和GSTP2（头肾、脾脏和皮肤除外）]以及GR的基因转录，提高了抗氧化酶活力和抗氧化能力，降低了氧化损伤产生的自由基对功能器官产生的氧化;通过下调c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)（前肠、头肾、脾脏和皮肤除外）、Fas配体(FasL)、促凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）和B细胞淋巴瘤蛋白-2相关X蛋白(Bax)（前肠除外）以及半胱天冬酶（caspase-2、3、7、8和9）基因表达以及上调抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、凋亡抑制因子IAP和抗凋亡因子髓细胞白血病基因-1(Mcl-1)基因表达，抑制了功能器官的细胞凋亡;通过下调MLCK mRNA水平上调了细胞间紧密连接蛋白occludin（头肾和鳃除外）、ZO-1、ZO-2、claudin-b（鳃除外）、claudin-c、claudin-f、claudin-3c（前、中、后肠除外）、claudin-7a、claudin-7b和claudin-11mRNA水平，下调了claudin-12、claudin-15a和claudin-15b，维持了功能器官细胞间结构完整性。
　　另一方面，适宜水平的日粮核苷酸提高了草鱼的功能器官抗菌物质[溶菌酶(LZ)、酸性磷酸酶(ACP)、补体（C3和C4）、免疫球蛋白(IgM)]含量，上调了抗菌肽(β-defensin)、铁调素(hepcidin)、肝脏表达抗菌肽2[LEAP-2A（鳃除外）和LEAP-2B）]和黏蛋白2(Mucin2)（前肠和中肠除外）mRNA水平;下调了促炎细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）（头肾、鳃除外）、干扰素γ2（IFN-γ2）（鳃除外）、白介素-1β(1L-1β)（前肠、中肠和后肠除外）、IL-6、IL-8（前肠、中肠和后肠除外）、IL-15、IL-17D、IL-12p35（鳃除外）和IL-12p40（头肾、脾脏和皮肤除外）mRNA水平;上调了抗炎细胞因子IL-10（前肠、中肠和后肠除外）、IL-11、TGF-β1、TGF-β2（前肠、中肠和后肠除外）、IL-4/13A（头肾、脾脏和皮肤除外）和IL-4/13B（鳃除外）mRNA水平;进一步下调了促炎症信号分子IκB激酶β(IKK-β)、IKK-γ、核因子-κB p52(NF-κBp52)（前肠、中肠、后肠和鳃除外），NF-κBp65和c-Rel mRNA水平，以及上调了抑制因子IκBα、TOR和S6K1mRNA水平，下调了4E-BP1和4E-BP2（前肠、中肠和后肠除外）mRNA水平，从而提高了鱼类功能器官的免疫功能。
　　此外，适宜水平的核苷酸提高了生长中期草鱼的营养品质、风味品质、保健品质和理化品质。通过提高肌肉中蛋白和脂肪含量、降低水分含量改善了肌肉营养品质;通过提高肌肉中鲜味氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）、甜味的氨基酸（丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸）和风味肌苷酸含量，改善了风味品质;通过提高肌肉n-3多不饱和脂肪酸（EPA和DHA）和降低饱和脂肪酸含量(P＜0.05)，从而提高了鱼肉保健品质;通过提高肌肉的系水力、嫩度和pH来增强物化品质。核苷酸提高了生长中期草鱼肌肉系水力与其下调肌肉p38MAPK、JNK、FasL、Apaf-1和Bax以及caspase-(2、3、7、8和9)以及上调抗凋亡蛋白Bcl-2和IAP mRNA水平从而降低凋亡有关;增加嫩度与其降低胶原蛋白含量和增加组织蛋白酶B和L活性有关;提高pH与其降低乳酸含量有关。核苷酸还通过调控Nrf2途径从而上调CuZnSOD等抗氧化酶基因转录，提高了肌肉抗氧化酶活力和抗氧化能力从而降低肌肉氧化，改善了肌肉品质。
　　综上所述，适宜水平的核苷酸能够提高生长中期草鱼的生产性能、肠道发育和降低肠炎、赤皮和烂鳃的发生和增强肌肉品质。通过增强功能器官抗氧化能力、抗凋亡能力和紧密连接特性从而维持细胞结构完整性;通过增加抗菌物质含量、抗菌肽基因表达和调控炎症细胞因子基因表达从而提高了功能器官免疫功能;通过提高营养品质、风味品质、保健品质和理化品质从而提高鱼肉品质。以PWG、抗肠炎、赤皮和烂鳃发病率、EPA、DHA、剪切力和pH为标识进行回归分析，确定的生长中期草鱼(200-734g)核苷酸适宜添加水平分别为517.97、580.35、626.71、526.38、604.53、594.28、540.61和615.76mg/kg。

目录

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摘要

符号说明

第一章选题背景

第二章文献综述

2．1．1核苷酸的结构特点

2．1．2核苷酸的功能

2．1．3核苷酸在动物体内合成

2．2核苷酸对水生动物生产性能的影响

2．3核苷酸对水生动物功能器官的影响

2．3．1核苷酸对鱼类功能器官结构完整性的影响

2．3．2核苷酸对鱼类功能器官免疫功能的影响

2．4日粮核苷酸对鱼类肌肉品质的影响

2．4．1核苷酸对鱼类风味物质的影响

2．4．2核苷酸对鱼类保健脂肪酸组成的影响

2．4．3核苷酸对鱼类肉质参数的影响

2．4．4核苷酸对鱼类鱼类肉质的可能作用机制

2．5日粮核苷酸的适宜添加量

2．6存在的问题

第三章研究目的和意义

3．1研究目的

3．2研究意义

第四章材料和方法

4．1生长试验

4．1．1试验设计

4．1．2基础日粮配方及主要营养指标

4．1．3生长试验及饲养管理

4．1．4样品采集

4．2攻毒试验

4．2．1试验条件和饲养管理

4．2．2样品采集

4．3指标测定

4．3．1生产性能指标

4．3．2肠道微生物计数

4．3．3组织病理学观察

4．3．4肌肉成分的测定

4．3．5抗氧化和免疫物质的测定

4．3．6 DNA片段化的测定

4．3．7基因表达测定

4．3．8蛋白免疫印迹

4．4数据统计分析与处理

第五章结果与分析

5．1核苷酸对生长中期草鱼生产性能的影响

5．2核苷酸对生长中期草鱼肠道健康的作用

5．2．1核苷酸对肠道结构完整性的影响

5．2．2核苷酸对生长中期草鱼肠道生长发育和肠道微生物的影响

5．2．3核苷酸对生长中期草鱼肠炎发病和组织病理学的影响

5．2．4核苷酸对草鱼肠道免疫功能的影响

5．3核苷酸对生长中期草鱼头肾、脾脏和皮肤健康的影响

5．3．1核苷酸对草鱼头肾、脾脏和皮肤结构完整性的影响

5．3．2核苷酸对草鱼赤皮发病率的影响

5．3．3核苷酸对草鱼头肾、脾脏和皮肤免疫相关指标的影响

5．4核苷酸对生长中期草鱼鳃健康的影响

5．4．1核苷酸对鳃结构完整性的影响

5．4．2核苷酸对烂鳃发病率的影响

5．4．3核苷酸对鳃免疫相关指标的影响

5．5核苷酸对生长中期草鱼肉质理化指标的影响

5．5．1核苷酸对草鱼肌肉常规营养成分

5．5．2核苷酸对草鱼肌肉游离氨基酸含量的影响

5．5．3核苷酸对草鱼肌肉脂肪酸组成的影响

5．5．4核苷酸对草鱼肌肉物化指标的影响

5．5．5核苷酸对草鱼肌肉细胞凋亡的影响

5．5．6核苷酸对草鱼肌肉抗氧化能力的影响

5．6相关分析结果

5．6．1肠道相关分析结果

5．6．2头肾、脾脏和皮肤相关分析结果

5．6．3鳃相关分析结果

5．7回归分析

第六章讨论

6．1核苷酸提高了鱼类生产性能

6．2核苷酸促进鱼类肠道健康

6．2．1核苷酸提高鱼类肠道结构完整性

6．2．2核苷酸提高鱼类肠道免疫功能

6．3核苷酸提高了鱼类头肾、脾脏和皮肤健康

6．3．1核苷酸提高了鱼类头肾、脾脏和皮肤的结构完整性

6．3．2核苷酸增强了鱼类头肾、脾脏和皮肤的免疫功能

6．4适宜水平的核苷酸增强了鱼类鳃健康

6．4．1核苷酸增强了鱼类鳃结构完整性

6．4．2核苷酸能增强鱼类鳃的免疫功能

6．5核苷酸改善了鱼类肌肉风味品质

6．5．1核苷酸提高了草鱼肌肉风味氨基酸和肌苷酸含量

6．5．2核苷酸提高了肌肉的保健品质

6．5．3核苷酸改善了鱼类肌肉的理化特性

6．5．4核苷酸提高了鱼类肌肉抗氧化能力

6．6核苷酸的最适添加水平

第七章结论

参考文献

致谢

作者简历