融合性鸭坦布苏病毒E基因和鸭IL-2基因重组腺病毒的构建及其免疫保护研究

摘要

自2010年4月鸭坦布苏病毒病在中国首次被发现以来，该病迅速在中国沿海地区广泛传播，给养殖产业造成了巨大的经济损失。本研究通过构建融合性鸭坦布苏病毒E基因和鸭白介素2基因的重组腺病毒质粒，为鸭坦布苏病毒病的重组腺病毒疫苗的开发奠定基础。
　　(1)重组腺病毒rADV-E-IL-2和rADV-E的构建及鉴定。用RT-PCR方法分别将1353bp的鸭坦布苏病毒E基因和鸭350bp的白介素2基因串联构成1733bp的融合片段克隆到腺病毒穿梭载体中，构建出重组腺病毒穿梭质粒pshuttle-E-IL-2，同时构建病毒E基因质粒pshuttle-E作为对照，分别与骨架载体共转染进HEK293细胞，经PCR和免疫印迹鉴定获得重组腺病毒rADV-E-IL-2和rADV-E。病毒可在HEK293细胞中连续传代20代以上，具有基因组稳定性。纯化后检测rADV-E-IL-2滴度达到4.0×1010PFU/mL，rADV-E滴度达到6.0×1010PFU/mL。
　　(2)重组腺病毒对雏鸭的免疫保护试验。将80只1日龄雏鸭随机均分为五组（rADV-E-IL-2组、rADV-E组、rADV-N组、WF100组和PBS组），分别用重组腺病毒rADV-E-IL-2、重组腺病毒rADV-E、空载的重组腺病毒rADV-N、商品化鸭坦布苏弱毒疫苗WF100株和PBS于雏鸭7日龄和21日龄进行皮下注射。结果显示，rADV-E-IL-2组和rADV-E组可诱导产生抗鸭坦布苏病毒的特异性IgG，rADV-E-IL-2组抗体水平在首免后35d达到最高峰1.39，和其余组相比差异性显著（P＜0.05）。rADV-E-IL-2组和rADV-E组均具有中和病毒能力，rADV-E-IL-2组和rADV-E组中和抗体效价在首免后35d达到最高峰，rADV-E-IL-2组为1∶55，rADV-E组为1∶44。rADV-E-IL-2组和rADV-E组均能显著提高外周淋巴细胞的增殖，增殖指数分别为3.13和2.69，与rADV-N组、PBS组相比差异性显著（P＜0.05）。rADV-E-IL-2组和rADV-E组血清中细胞因子IL-2含量(94.78pg/mL、76.18pg/mL)、IL-6含量(66.43pg/mL、59.45pg/mL)和IFN-γ含量(201.51pg/mL、128.61pg/mL)与rADV-N组、PBS组相比差异性显著(P＜0.05)。在攻毒保护试验中，rADV-E-IL-2组和rADV-E组雏鸭未发生临床症状，剖检脾脏无病变。rADV-E-IL-2组检测脾脏内鸭坦布苏病毒拷贝数为1011.22copies/μL，rADV-E为101.81copies/μL，两者与rADV-N组、PBS组相比差异性显著（P＜0.05）。

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摘要

缩写词表

第一章文献综述

1鸭坦布苏病毒基因组及其结构

2鸭坦布苏病毒E蛋白的结构

3鸭坦布苏病毒E蛋白的抗原性

4鸭坦布苏病毒E蛋白在免疫应答中的作用

5鸭坦布苏病毒E蛋白的遗传特性

6鸭坦布苏病毒E蛋白的应用研究

7选题意义

第二章融合性鸭坦布苏病毒E基因和鸭IL-2基因重组腺病毒的构建

1．3仪器设备

2方法

2．1引物设计

2．2目的基因扩增

2．3重组穿梭质粒的构建

2．4重组腺病毒的包装

3结果

3．1目的基因PCR扩增

3．2重组穿梭质粒的构建

3．3重组腺病毒的包装

3．4重组腺病毒的鉴定

4讨论

5小结

第三章融合性鸭坦布苏病毒E基因和鸭IL-2基因重组腺病毒在鸭体内诱导的保护性免疫反应

1材料

1．1试验动物、毒株、疫苗株

1．2主要试剂

1．3主要仪器

2方法

2．1试验动物分组及免疫

2．2血清中特异性IgG检测

2．3血清中和抗体检测

2．4鸭外周淋巴细胞增殖试验

2．5血清中IL-2、IL-6和IFN-γ的测定

2．6攻毒保护试验

2．7统计学分析

3结果

3．1血清中特异性IgG检测

3．2血清中和抗体检测

3．3鸭外周淋巴细胞增殖试验

3．4血清中IL-2、IL-6和IFN-γ的测定

3．5攻毒保护试验

4讨论

5小结

参考文献

致谢

作者简历