患溃疡病或正常猕猴桃内生及土壤细菌多样性及群落结构研究

摘要

猕猴桃细菌性溃疡病一直是世界性难题，且至今未有完全有效的防治手段。本研究从都江堰地区红阳猕猴植株发病组织中成功分离出该病致病菌并利用传统分离方法、变性梯度凝胶电泳手段、及高通量测序技术探究患溃疡病猕猴桃与正常猕猴桃之间内生及土壤细菌群落结构及多样性差异。获得如下研究结果:传统培养分离结果显示，患病根际土壤细菌种群数量显著低于正常根际土壤细菌，且种系结构也存在差异，从猕猴桃种植土壤中筛选到10株具有明显抑菌活性的菌株，这些菌株在猕猴桃溃疡病的生物防治上有应用潜力;变性梯度凝胶电泳指纹图谱结果显示，患病枝条内生细菌Shannon多样性指数及Simpson多样性指数显著低于正常枝条，患病枝条内能够检测到微弱的溃疡病致病菌条带，该病原菌在正常枝条内检测不到，这进一步验证了丁香假单胞菌猕猴桃致病变种是猕猴桃细菌性溃疡病致病菌这一结论，而正常枝条内能够检测到拟杆菌门细菌，该菌在患病枝条内几乎检测不到，此外，患病枝条中大黄欧文菌组成比例较高、酸杆菌门组成比例较低;NGS结果显示，患病根际土壤Chao1多样性指数及ACE指数显著低于正常根际土壤;患病枝条Chao1指数、ACE指数、Shannon指数及Simpson指数显著低于正常枝条，寡养单胞菌属、Mizugakiibacter属在患病根际土壤中显著较高，链孢子囊菌属及立克次氏小体属在正常根际土壤中显著较低，假单胞菌属在患病枝条中较高，而甲烷菌属在正常枝条中较高，此外，土壤理化因子变化与细菌多样性变化显著相关。本研究揭示出都江堰地区患溃疡病红阳猕猴桃与正常红阳猕猴桃之间内生或根际土壤细菌多样性及群落结构差异，为今后猕猴桃细菌性溃疡病生物防治提供了有效参考。

目录

声明

摘要

文献综述

1猕猴桃产业价值及受溃疡病的影响

1．1猕猴桃产业价值

1．2猕猴桃细菌性溃疡病的发生及影响

1．3猕猴桃细菌性溃疡病研究现状

1．4猕猴桃细菌性溃疡病防治进展

1．5都江堰猕猴桃产业现状

2细菌群落与植物病害的关系

2．1植物免疫与植物病害的关系

2．2细菌群落对植物免疫的意义

2．1根际土壤细菌对植物生理的意义

2．2植物内生细菌对植物生理的意义

3细菌多样性及群落结构研究方法进展

3．1传统分离培养手段

3．2分子技术手段

3．3第二代测序技术手段

研究目的及意义

第一章细菌性猕猴桃溃疡病致病菌分离与验证

1材料与方法

1．1试验材料

1．2试剂样品

1．3分离致病菌

1．4验证致病性

2结果与分析

2．1病原菌分离与特异条带扩增结果

2．2 16S rRNA扩增测序结果与系统发育树构建

2．3柯赫氏法则验证结果

3讨论分析

4小结

第二章纯培养分析患溃疡或正常猕猴桃根际土壤细菌群落及抑菌活性

1材料与方法

1．1样品采集

1．2试剂样品

1．3土壤细菌分离培养

1．4细菌基因组DNA提取及16S rRNA扩增测序

1．5抑菌活性分析

1．6数据分析

2结果与分析

2．1细菌16S rRNA比对

2．2不同培养基分离试验土壤细菌的差异分析

2．3土壤细菌种系结构分析

2．4细菌抗菌活性检测

2．5土壤样品中抗菌活性种系相对含量分析

3讨论分析

4小结

第三章PCR-DGGE分析患溃疡或正常猕猴桃内生细菌群落

1材料与方法

1．1样品采集与表面消毒

1．2试剂样品

1．3基因组提取与PCR-DGGE扩增准备

1．4变性凝胶梯度电泳与克隆测序

1．5克隆测序

1．6数据分析

2结果与分析

2．1基于PCR-DGGE方法的多样性指数分析

2．2基于PCR-DGGE方法的群落结构分析

3讨论分析

4小结

第四章NGS分析患溃疡或正常猕猴桃内生及根际土壤细菌多样性及群落结构

1材料与方法

1．1样品采集

1．2试剂样品

1．3高通量测序分析

1．4土壤理化因子测定

1．5分析技术

2结果与分析

2．1基于NGS方法的细菌群落多样性分析

2．2基于NGS方法的细菌群落结构分析

2．3土壤理化因子变化分析

3讨论分析

4小结

结论

参考文献

致谢