miR-148a-3p靶向PTEN促进家兔前体脂肪细胞分化

摘要

目前，研究表明，miR-148a-3p可以调控前体脂肪细胞的分化以及脂质的形成;PTEN可以通过抑制PI3K-AKT信号通路抑制前体脂肪细胞分化;PTEN是miR-148a-3p的一个潜在的靶基因。本试验旨在建立体外家兔诱导分化模型以及验证miR-148a-3p可以靶向PTEN调控家兔前体脂肪细胞成脂分化。试验结果如下:
　　(1)miR-148a-3p在5月龄家兔肾周脂肪组织中的表达量极显著高于初生仔兔(P＜0.01);
　　(2)成功分离家兔前体脂肪细胞，鸡尾酒法诱导成脂分化后，油红O染色发现第二天出现大量的小脂滴，第六天开始出现脂滴的汇聚，第十天时，脂滴明显增多，且大脂滴也明显增多，出现成熟脂肪细胞的特征。标志基因测定发现，符合前体脂肪细胞分化规律。随着前体脂肪细胞分化时间的推移，miR-148a-3p的表达量呈逐渐上调的趋势;
　　(3)转染miR-148a-3p类似物mimic后，细胞内miR-148a-3p的表达显著上调(P＜0.01)。诱导前体脂肪细胞分化，结果显示mimic可以促进前体脂肪细胞分化，脂肪细胞分化标志基因PPARγ、C/EBPα和FABP4基因的mRNA水平均显著上升(P＜0.05)，脂肪酸和甘油三酯的含量极显著增加(P＜0.01)。转染miR-148a-3p抑制剂inhibitor，细胞内miR-148a-3p的表达显著下调(P＜0.05)。诱导前体脂肪细胞分化，结果显示inhibitor可以抑制前体脂肪细胞分化，标志基因PPARγ、C/EBPα和FABP4基因的mRNA水平均显著降低(P＜0.05)，脂肪酸和甘油三酯的含量极显著降低(P＜0.05)。
　　(4)生物信息学预测结果发现，PTEN基因是miR-148a-3p的一个潜在的靶基因，且有两个结合位点。双荧光素酶报告试验发现，miR-148a-3p可以作用PTEN基因的其中一个位点(P＜0.01），另一个结合位点并无靶向关系。
　　(5)过表达miR-148a-3p后，可以下调PTEN基因mRNA和蛋白质的表达水平(P＜0.01）。抑制表达miR-148a-3p后，可以上调PTEN基因mRNA和蛋白质的表达水平(P＜0.05）。
　　(6)抑制家兔前体脂肪细胞内源性PTEN基因的表达量，PTEN表达量下降了约60％，可以促进细胞成脂分化，上调脂肪酸的合成，甘油三脂的含量，分化相关基因C/EBPα、PPARγ和FABP4基因的mRNA水平均显著上升(P＜0.05)，与过表达miR-148a-3p实验结果一致。
　　综上所述，体外家兔诱导分化模型建立成功，且在家兔前体脂肪细胞分化过程中，miR-148a-3p可以通过靶向PTEN基因促进家兔前体脂肪细胞分化。

目录

论文说明

声明

摘要

1文献综述

1．1脂肪细胞的简介及分类

1．2调节脂肪细胞分化的转录因子及标志基因

1．2．1脂肪细胞分化主要转录调控因子

1．3调节脂肪细胞分化的信号通路

1．3．1 WNT信号通路

1．3．2 TGFβ超家族信号通路

1．4 PTEN基因与脂肪细胞分化的研究进展

1．5 miRNA与脂肪细胞分化

1．5．1 miRNA与脂肪细胞分化研究进展

1．5．2 miR-148a-3p的研究进展

1．6本研究目的与意义

2．实验材料与方法

2．1常用仪器和方法

2．1．1材料与仪器

2．1．2试剂

2．1．3试齐0的酉己制

2．2试验方法

2．2．1家兔前体脂肪细胞原代培养

2．2．2家兔前体脂肪细胞的传代培养

2．2．3家兔前体脂肪细胞的冻存

2．2．4前体脂肪细胞的诱导分化

2．2．5油红O染色

2．2．7细胞转染

2．2．8 RNA提取

2．2．10 cDNA的合成

2．2．11 QRT-PCR

2．2．12蛋白质的抽提

2．2．13蛋白质浓度的测定

2．2．1 4 Western blotting

2．2．15甘油三脂的测定

2．2．16靶基因预测

2．2．17双荧光素酶报告验证靶基因

2．2．18数据的分析

3．结果与分析

3．2家兔原代前体脂肪细胞的分离培养

3．3家兔原代前体脂肪细胞成脂分化模型建立

3．4过表达miR-148a-3p促进家兔前体脂肪细胞分化

3．5抑制表达miR-148a-3p抑制家兔前体脂肪细胞分化

3．6 miR-148a-3p靶基因验证

3．7过表达和抑制表达miR-148a-3p对PTEN基因的影响

3．8抑制PTEN基因对家兔前体脂肪细胞分化的调节作用

4．讨论

4．2家兔原代前体脂肪细胞诱导分化模型建立

4．3 miR-148a-3p促进家兔前体脂肪细胞分化

4．4PTEN是miR-148a-3p的靶基因

4．5抑制PTEN基因促进家兔前体脂肪细胞分化

5结论

参考文献

致谢

作者简历