miR159a调控玉米淀粉合成关键酶基因表达的分子途径

摘要

玉米是世界上的主要粮食作物之一，籽粒中的贮藏淀粉是它的主要利用产物。玉米淀粉的生物合成是在一系列淀粉合成相关酶的协同作用下催化完成的。参与淀粉生物合成的关键酶有:腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)、淀粉去分支酶(DBE)以及淀粉磷酸化酶(SP)。近年来很多研究表明转录调控是淀粉生物合成过程中的主要调控机制，同时研究发现miRNA可以通过靶向作用调控转录因子。
　　在实验前期我们进行了授粉后不同时期胚乳的miRNA的高通量测序，差异表达分析得到了miR159a并预测其靶基因。同时结合maizeGDB的eFP browser和RNA-seq发现靶基因中的转录因子ZmMYB138和ZmMYB115在胚乳中特异性高表达，可能参与淀粉合成关键酶基因的调控。本研究在此基础上，采用基因枪瞬时表达和酵母单杂交的手段验证miR159a对转录因子ZmMYB138和ZmMYB115的调控作用以及转录因子ZmMYB138和ZmMYB115对淀粉合成关键酶基因表达的调控作用。研究得到的主要结果如下:
　　1.为验证miR159a对转录因子ZmMYB138和ZmMYB115的调控作用，采用基因枪轰击新鲜玉米胚乳法将瞬时表达载体转入胚乳中，测定hRLuc/Gus活性。结果表明，miR159a极显著抑制ZmMYB115的mRNA含量，显著抑制ZmMYB138的mRNA含量。
　　2.为了验证转录因子ZmMYB138对玉米淀粉合成关键酶基因启动子活性的影响，采用基因枪轰击新鲜玉米胚乳法将瞬时表达载体转入胚乳中，测定Luc/Gus活性。结果表明，转录因子ZmMYB138对淀粉分支酶类ZmSBE2b基因启动子的活性具有极显著促进作用;对淀粉腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶类ZmBt2基因启动子的活性具有显著促进作用;对可溶性淀粉合酶类基因ZmSSⅡa和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶类小亚基基因ZmSh2的启动子活性没有显著作用。
　　3.为了验证转录因子ZmMYB138与淀粉合成关键酶基因ZmSBE2b和ZmBt2的启动子是否为直接结合作用，采用LiAc-PEG法将酵母单杂交重组载体转入酵母菌株Y187中，通过酵母单杂交分析ZmMYB138与启动子片段的作用模式。结果表明转录因子ZmMYB138与ZmBt2基因启动子以及ZmSBE2b基因启动子均具有直接的结合作用。
　　4.为了验证转录因子ZmMYB115对玉米淀粉合成关键酶基因启动子活性的影响，采用基因枪轰击新鲜玉米胚乳法将瞬时表达载体转入胚乳中，测定Luc/Gus活性。结果表明，转录因子ZmMYB115对颗粒结合型淀粉合酶类ZmGBSS基因启动子的活性具有极显著促进作用;对可溶性淀粉合酶类ZmSSⅢa和ZmSSⅠ基因启动子以及腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶类小亚基基因ZmSh2的启动子活性没有有显著作用。
　　5.为了验证转录因子ZmMYB115与淀粉合成关键酶基因ZmGBSS、ZmSSⅢa和ZmSSI基因启动子是否为直接结合作用，采用LiAc-PEG法将酵母单杂交重组载体转入酵母菌株Y187中，通过酵母单杂交分析ZmMYB115与启动子片段的作用模式。结果表明转录因子ZmMYB115与ZmGBSS、ZmSSⅢa和ZmSSI基因启动子均具有直接的结合作用。
　　通过以上实验结果可以初步得出结论:miR159a通过负调控转录因子ZmMYB138和ZmMYB115的mRNA水平进而影响淀粉合成关键酶基因ZmSBE2b、ZmBt2、ZmGBSS的表达，最终参与调控淀粉的生物合成。

目录

声明

摘要

缩写表

1．文献综述

1．1淀粉的生物合成及淀粉生物合成相关关键酶

1．1．1腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)

1．1．2淀粉合酶(SS)

1．1．3淀粉分支酶(SBE)

1．1．4淀粉去分支酶(DBE)

1．1．5淀粉磷酸化酶(sP)

1．2转录因子

1．2．1转录因子的分类及作用

1．2．2 MYB转录因子

1．3 miRNA

1．4研究的目的和意义

1．5技术路线

2．实验材料与方法

2．1实验材料

2．1．1植物材料

2．1．2菌株与载体

2．1．3酶及试剂

2．1．4主要仪器

2．2实验方法

2．2．1生物信息学分析方法

2．2．2 ZmMYB138和ZmMYB115基因的克隆

2．2．3 ZmMYB138和ZmMYB115基因枪瞬时表达实验

2．2．4 ZmMYB138和ZmMYB115酵母单杂交实验

3．结果与分析

3．1．1 miR159a的靶基因预测

3．1．2 ZmMYB138和ZmMYB115基因的克隆、序列分析及进化分析

3．1．3 miR159a对转录因子ZmMYB138和ZmMYB115的调控作用

3．2 ZmMYB138对淀粉合成关键酶基因启动子活性的影响

3．3 ZmMYB138与淀粉合成关键酶基因启动子的作用模式分析

3．3．2 ZmMYB138与淀粉合成关键酶基因启动子的作用模式分析

3．4 ZmMYB115对淀粉合成关键酶基因启动子活性的影响

3．4．2 ZmMYB115对淀粉合成关键酶基因启动子活性的影响

3．5 ZmMYB115与淀粉合成关键酶基因启动子的作用模式分析

3．5．2 ZmMYB115与淀粉合成关键酶基因启动子的作用模式分析

4．讨论

4．1 miRNA对转录因子的调控

4．2 MYB类转录因子的功能

4．3 miR159a影响淀粉合成关键酶基因的表达

参考文献

附录

致谢

作者简历