人骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导分化成血管内皮细胞能力的研究

摘要

【目的】探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外特定的条件下分化成血管内皮细胞的可能性，并比较ATRA(全反式维甲酸)、IGF-1(类胰岛素生长因子)在诱导MSCs体外成内皮细胞过程中的作用。 【方法】经密度梯度离心和贴壁培养相结合的方法从人骨髓中分离提纯间充质干细胞(MSCs)，分别加入两种诱导培养基Ⅰ(M199培养基+10％胎牛血清+100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素+VEGF10ng/ml+bFGF5ng/ml+IGF-12ng/ml)、A(M199培养基+10％胎牛血清+100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素+VEGF10ng/ml+bFGF5ng/ml+ATRA1μmol/L)中作为实验组I、A；以未添加细胞因子的MSCs作为阴性对照组M；以内皮细胞作为阳性对照组E。分别在光学显微镜下、倒置显微镜下、电镜下观察4组细胞形态和细胞计数；并对4组细胞行Ⅷ因子免疫组化染色、流式细胞术测细胞表面CD34、KDR的表达、RT-PCR法检测培养细胞KDR的表达、Western法检测培养细胞vWF的表达。 【结果】M组MSCs细胞成为纺锤形、梭形的成纤维细胞形态；I、A组MSCs加入诱导分化剂后均可见到部分扁平宽大的长梭形细胞胞质向核收缩，变为不规则形，多角形或圆形，而这与E组内皮细胞形态相似。 在相同试验条件下，加入实验组I和实验组A中的相同密度MSCs细胞后，部分细胞死亡，细胞密度较M组减少，细胞生长速度低于M组。A组与I组相比：A组细胞贴壁时间较晚，死亡细胞较I组为多，存活细胞密度较I组低。培养初期，A组细胞生长速度、细胞活力均低于I组；而4天后A组细胞生长速度加快，到第7天末所获细胞数接近I组。 培养细胞行Ⅷ因子免疫组化染色后镜下所见：I组、A组部分细胞胞浆中可见棕黄色颗粒，且I组、A组阳性细胞数分别为约7.57±4.21％、8.10±3.73％，两组比较P＞0.05，无统计学意义。 培养7天的细胞做透射电镜检测，可观察到I、A组部分细胞胞浆内可见Weibel-Palade小体。 流式细胞术结果显示：I组、A组KDR、CD34荧光强度值均比M组高，(P＜0.05)，差异有统计学意义。A组与I组细胞表达CD34相比，(P＞0.05)，差异无统计学意义。A组与I组细胞相比表达KDR较少，(P＜0.05)，差异有统计学意义。 RT-PCR结果显示：KDR基因在M组不表达，而在A组、I组、E组均有表达。 Western法检测培养细胞vWF的表达：M组未出现vWF阳性条带，而A组、I组和E组一样均出现vWF阳性条带。 【结论】：1.经密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法可以得到较纯净的MSCs。 2.MSCs在诱导分化剂Ⅰ(VEGF+bFGF+IGF-1)、A(VEGF+bFGF+ATRA)作用下均可部分分化为内皮细胞。 3.诱导分化剂A开始诱导能力弱于诱导分化剂Ⅰ，随着诱导时间延长，诱导分化剂A诱导能力加强。

目录

声明

前 言

试验材料与仪器

实验方法

讨 论

结 论

参考文献

文献综述间充质干细胞分化为血管内皮细胞的研究

参考文献

致 谢