腺病毒介导突变型HIF-1α基因对体外诱导环境人骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响

摘要

本实验构建了携突变型HIF-1α基因的重组腺病毒载体，通过转染体外诱导培养hMSCs，研究HIF-1α表达或增强其表达后对5-aza诱导hMSCs成为心肌样细胞过程的影响，以进一步明确HIF-1α的心脏保护活性，为进一步研究HIF-1α基因及其突变型对缺血性心脏病的血管新生作用及以后的临床应用奠定基础。本课题分四个部分进行研究。 方法 第一部分：本课题组所构建的重组腺病毒载体HIF-1α<,nature>、Ad-HIF-1α<,564>、Ad-HIF-1α<,564/402>和Ad-HIF-1α<,564/803>连同对照病毒Ad-LacZ，在HEK293细胞内大量扩增后终点稀释实验法测定病毒滴度，再经氯化铯梯度离心法纯化；采用PCR方法对纯化后病毒所携突变型HIF-1α基因进行完整性鉴定；采用扫描电镜对纯化后病毒进行形态学鉴定；以Ad-LacZl感染HEK293细胞，经X-gal染色确定转染效率；重组腺病毒Ad-LacZ、Ad-HIF-1α<,nature>、Ad-HIF-1α<,564>、Ad-HIF-1α<,564/402>和Ad-HIF-1α<,564/803>体外转染Hela细胞评价其生物安全性。 第二部分：取本院成人检查骨髓正常结果的骨髓标本。按Pittenger的方法，分离骨髓标本，取单个核细胞层培养、传代。取第1、5、10代的贴壁细胞达到80-90％融合后，流式细胞仪Becton Dickinson FACScan检测FITC-Anti-HLA-DR/CD13-PE；FITC-CD45/CD34-PE；FITC-CD44/CD29-PE的表达。1 μmol/L地塞米松、0.5mmol/L IBMX，10μg/ml胰岛素的条件定向诱导hMSCs向脂肪细胞分化，第14 d实验组与对照组均行油红O染色。0.1μmol/L地塞米松，10mmol/Lβ-甘油磷酸，50μmol/L Vit.C条件定向诱导hMSCs向成骨细胞分化。第28 d Von Kossa’s染色及茜素红染色显示钙盐沉着。第三部分：用终浓度为10μmol/L 5-aza对第5代达到对数生长期的hMSCs进行诱导培养，作用24h，诱导后培养使用含5％胎牛血清DMEM-LG培养基，每3-4d酌情换液。诱导培养第28 d收获细胞，用免疫细胞化学方法检测肌系细胞的标记抗原及心肌特异性标记抗原：α-Actin、Connexin 43和心肌肌钙蛋白T(cardiactroponin T，cTnT)。 第四部分：Ad-LacZ感染hMSCs，经X-gal染色确定转染效率；重组腺病毒Ad-LacZ、Ad-HIF-1α<,nature>、Ad-HIF-1α<,564>、Ad-HIF-1α<,564/402>和Ad-HIF-1α<,564/803>以最佳转染复数转染hMSCs后用5-aza对其进行诱导培养，分别于诱导培养后的第14、28、32d，提取细胞浆蛋白行cTnI检测。诱导的第28 d提取细胞浆蛋白，用Westernblot方法检测HIF-1α和VEGF蛋白表达水平。 结果 第一部分：在HEK293细胞内扩增后的重组腺病毒Ad-LacZ、Ad-HIF-1α<,natrue>Ad-HIF-1α<,564>、Ad-HIF-1α<,564/402>和Ad-HIF-1α<,564/803>的滴度分别为1.99×10<'12> pfu/ml、6.31×10<'12>pfu/ml、3.98×10<'12> pfu/ml、10.0×10<'12> pfu/ml和1.26×10<'12> pfu/ml；经氯化铯梯度离心法纯化后滴度分别为(7.755±0.477)×10<'11>OPU/ml、(5.077±0.188)×10<'11>OPU/ml、(6.848±0.129)×10<'11>OPU/ml、(6.292±0.260)×10<'11>OPU/ml和(6.193±0.221)×10<'11>OPU/ml；纯化后病毒PCR检测腺病毒骨架及所携HIF-1α基因均得到预期的287bp、380bp、460bp和214bp扩增产物，且DNA测序结果符合实验设计要求；电镜结果显示腺病毒形态学特点，无支原体、衣原体污染；转染HEK293后X-gal染色显示，最佳转染复数为50 pfu/cell。 第二部分：㈠、hMSCs的分离、培养：Ficoll分离液(1.077g/ml)分离得到的单个核细胞24 h后贴壁，细胞呈圆形，48-72 h后呈纺锤形、梭形、多角形，增殖迅速，原代培养约14-20 d可达到80-90％融合。传代细胞24 h内完全贴壁，5-7 d内达到80-90％融合。并传代至第7-10代。㈢、流式细胞仪检测表面标记物：生长良好的贴壁细胞在第1、5、10代时行表面标记物检测。第5代细胞均一性达到94％左右。CD34、CD45、HLA-DR阴性但CD13，CD29和CD44阳性。㈢、定向诱导为脂肪细胞：第3 d起光镜下可见脂滴沉着的细胞，外形变为圆形，椭圆形，第14 d油红O染色示胞核呈蓝色，脂滴呈橙红色。随着时间延长，脂肪细胞比例逐渐增高。对照组无脂滴出现。㈣、定向诱导为成骨细胞：细胞呈现立方形外观。Von Kossa’s染色及茜素红染色均能显示矿化物(钙盐)的沉积，而且随着诱导时间的延长不断增高。对照组无矿化物(钙盐)的沉积。 第三部分：10μmol/L 5-aza诱导后，细胞形态变大，排列方向更趋一致，细胞增殖减慢，部分细胞脱壁死亡，2-3 W可见少数细胞胞体粗大，呈长方形。5-aza诱导培养28 d的爬片细胞经免疫细胞化学染色检测肌系细胞标志，显示部分诱导细胞表达α-Actin，Connexin 43和cTnT，阳性细胞率分别为(32.27±13.17)％、(29.51±5.22)％和(19.96±4.01)％。在未经5-aza诱导的同培养天数的hMSCs中未见表达。 第四部分：随着MOI值的升高，Ad-LacZ的转染效率和基因表达增强，在MOI值为75 OPU/cell时，Ad-LacZ转染心肌细胞的效率高于90％。诱导的第14、28、32 d，Ad-LacZ、Ad-HIF-1α<,nature>、Ad-HIF-1α<,564>、Ad-HIF-1α<,564/402>和Ad-HIF-1α<,564/803>四组均促进hMSCs向心肌样细胞转化，与对照Ad-LacZ组相比差异有显著性(P=0.000)，Ad-HIF-1α<,nature>、Ad-HIF-1α<,564>和Ad-HIF-1α<,564/402>三组cTnI值，与Ad-HIF-1α<,564/803>相比，亦有显著性差异，P值分别为0.001、0.001以及0.021。但是Ad-HIF-1α<,natrue>、Ad—HIF-1α<,564>和Ad-HIF-1α<,564/402>组间差异无显著性，P值分别为0.974、0.229和0.217。Western blot结果显示Ad-HIF-1α<,nature>、Ad-HIF-1α<,564>、Ad-HIF-1α<,564/402>、Ad-HIF-1α<,564/803>四组HIF-1α蛋白表达水平较Ad-LacZ组高。VEGF蛋白表达也上升。 结论 第一部分：本课题组构建的重组腺病毒载体Ad-LacZ、Ad-HIF-1α<,nature>、Ad-HIF-1α<,564>、Ad-HIF-1α<,564/402>和Ad-HIF-1α<,2564/803>滴度高、转染效率高且安全，为下一步实验提供了保证。 第二部分：骨髓分离、培养hMSCs获得成功，依据如下：(一)、从骨髓分离、培养单个核细胞呈贴壁生长，成纤维细胞样外观。(二)、高表达CD13、CD29和CD44．CD34、CD45和HLA-DR表达极低。(三)、可以被定向诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。 第三部分：5-aza可以诱导纯化培养的hMSCs向心肌样细胞转化，表达肌系蛋白及心肌特异性蛋白。含5％胎牛血清：DMEM-LG培养基适合于hMSCs向心肌样细胞诱导分化的体外实验研究。 第四部分：野生型HIF-1α基因及其突变型能促进5-aza诱导的hMSCs向心肌细胞转化，为HIF-1α进一步应用于心肌再生奠定了实验基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

引言

第一部分携突变体HIF-1α基因腺病毒载体的扩增、滴度测定、纯化及鉴定

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

本部分结论

参考文献

第二部分人骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

本部分结论

参考文献

第三部分5-氮胞苷体外诱导人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

本部分结论

参考文献

第四部分腺病毒介导突变型HIF-1α基因对体外诱导环境人骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

本部分结论

参考文献

全文小结

本研究不足之处

致谢