噬菌体随机环7肽库筛选胰岛素受体高亲和肽作为肝细胞癌靶向载体

摘要

背景：肿瘤细胞高表达分子被作为肿瘤靶向治疗的药物靶点。肿瘤靶向治疗有三种研究策略。第一种策略是获得肿瘤药物靶点的单克隆抗体。第二种策略是噬菌体肽库筛选获得与药物靶点分子高亲和力结合的小分子肽。第三种策略是获得生长因子片段及其衍生物，以阻断生长因子受体的功能。 胰岛素受体是一种生长因子受体，在肝癌细胞表面表达高于正常肝细胞，是肝癌靶向治疗的侯选靶点分子之一。噬菌体肽库是在一种噬菌体外壳蛋白末端连接上大量结构各异的肽链。当肽库与胰岛素受体结合，只有与受体具有高亲和力的多肽被筛选出来。通过提取噬菌体DNA测序获得多肽的氨基酸残基序列。再用多肽合成仪人工合成多肽。这种多肽可能具有肝癌等肿瘤靶向性。用噬菌体肽库筛选肿瘤高表达分子的高亲和力多肽是研究肿瘤靶向药物的一条重要途径。 目的：噬菌体随机环7肽库筛选能与胰岛素受体高亲和力结合的多肽，人工合成多肽作为放射性核素或肿瘤化疗药物载体，用于肝癌的放射性核素显像诊断和肝癌的靶向治疗。 方法：筛选：将大鼠肝胰岛素受体包被在培养皿上，用噬菌体环7肽库与胰岛素受体结合，收集结合在固相受体上的噬菌体。扩增筛选获得的噬菌体后用于下一轮筛选。通过数轮筛选，获得与受体亲和力高的噬菌体。测序：与受体亲和力高的噬菌体在LB培养皿上感染大肠杆菌ER2738，以蓝白斑实验挑取携带噬菌体的大肠杆菌克隆。扩增12个噬菌体单克隆，并用ELISA定性法测定噬菌体与胰岛素受体的亲和力。提取了11个胰岛素受体结合实验阳性、且OD值较高的噬菌体克隆DNA测序，获知连接在噬菌体外壳pⅢ蛋白末端的环7肽氨基酸残基序列。多肽亲和力鉴定：固相法多肽合成仪合成环7肽，并暂时定名为CY-10。125I标记CY-10用于与胰岛素受体的体外结合分析。体外结合实验包括饱和分析、Scachard分析、竞争抑制实验等。 CY-10亲肿瘤特性：比较CY-10结合肝癌细胞和正常肝细胞的差异。研究125I-CY-10在肝癌SMMC7721细胞荷瘤裸鼠体内分布。131I标记CY-10作肝癌SMMC7721细胞荷瘤裸鼠全身显像，了解131I-CY-10在肝癌组织的分布。 根据CY-10在荷瘤鼠的体内分布和显像表现，评价CY-10作为肝细胞癌靶向诊断和治疗的可能性。 结果：●通过三轮亲和筛选，每轮筛选噬菌体的回收处于同一水平。挑取第三轮筛选获得的噬菌体克隆12个进行扩增，ELISA定性分析12个噬菌体与胰岛素受体的结合能力，结果表明12个克隆全部为阳性反应。挑取11个OD值较高的阳性噬菌体克隆提取DNA测序，结果显示12个噬菌体克隆的插入序列完全相同。插入序列的结构是：ATGACGCCAATGCTTCGACTG。翻译成多肽的序列是QSKHWRH。 ●根据测序结果，设计并人工合成环10肽C-QSKHWRH-C-Y，暂时命名为CY-10。125I-CY-10与胰岛素受体结合的离解常数Kd值为8.901×10-8mol/L。与猪胰岛素比较，CY-10与胰岛素受体的亲和力更高，IC50CY/IC50Ins=1.716。 ●CY-10和SMMC7721细胞株的结合能力高于和正常肝细胞株L-02的结合能力。荷瘤裸鼠体内分布实验显示，肿瘤摄取高峰出现在注射后3小时，3小时肿瘤/肌肉的％ID/g比值为2.2218。其他组织器官摄取高峰出现在1小时。CY-10注射后15小时，大多数内脏器官CY-10分布明显下降，肿瘤组织下降幅度小，适合动物全身显像。24小时13I-CY-10荷肝癌鼠全身显像示肿瘤组织摄取高于对侧正常组织。 结论：1.研究获得了一种与胰岛素受体有高亲和力的多肽； 2.胰岛素受体高亲和肽CY-10具有一定的趋肝癌特性。

目录

声明

摘要

引言

第一部分噬菌体随机环7肽库筛选胰岛素受体高亲和肽

第一节亲和筛选

一、目的：

二、原理

三、材料和方法：

四、结果：

第二节单克隆噬菌体DNA序列测定

第二部分多肽合成、标记、多肽与胰岛素受体亲和力测定

第三节人工合成多肽(CY-10)

第四节放射性碘标记CY-10

第五节CY-10与胰岛素受体亲和力测定

第六节IC5 OCY/IC50INS

第三部分CY-10趋肝癌特性研究

第七节CY-10肝癌细胞株趋向性研究

第八节CY-10在SMMC-7721肝癌裸鼠的体内分布

第九节CY-10在SMMC-7721肝癌裸鼠的全身显像

讨论

参考文献

综述噬菌体肽库筛选在生物医学研究中的应用

致谢

附DNA测序图（一）

附DNA测序图（二）

附：11个阳性克隆的测序结果

结合胰岛素受体的胰岛素位点研究

博士期间以第一作者身份发表论文