2型糖尿病家系中高甘油三酯血症患者脂蛋白脂酶基因突变及功能分析

摘要

本项研究包括三部分：1.2型糖尿病家系中高甘油三酯血症患者脂蛋白脂酶基因分子筛查 目的：对成都地区汉族人群2型糖尿病(T2DM)家系中伴高甘油三酯血症(HTG)患者进行脂蛋白脂酶(LPL)基因分子筛查。方法：选取成都地区汉族人群中符合入选条件的T2DM家系，从T2DM家系中选择TG≥2.25mmol/L的患者进行LPL基因分子筛查，53人符合此标准，其中T2DM患者31人，糖耐量减低者(IGT)11人，糖耐量正常(NGT)者11人，这53人共代表了26个T2DM家系，TG范围在2.3-13.0mmol/L。正常对照118例。用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和聚合酶链反应-变性高效液相色谱(PCR-DHPLC)对LPL基因进行突变检测，然后对检出的突变位点通过DNA序列分析进一步证实，对发现突变位点的家系成员进行筛查，同时在正常群体中筛查这些突变位点的频率。对所有研究对象均进行血糖、血脂和胰岛素测定，计算体重指数(BMI)。 结果：1.在LPL基因外显子检测到7种突变，分别是：Ala71Thr、Val108Val、Leu286Pro、Asn291Ser、Lys312insC、Thr361insA和Leu376Leu。其中Lys312insC、Thr361insA和Leu376Leu是本研究中新发现的突变位点，以前从未报道过。 2.对新发现的Lys312insC和Thr361insA突变位点在家系成员中进行进一步筛查，结果显示8＃家系同时携带了Asn291Ser和Lys312insC突变，这两突变相互间有协同效应，并与家系中HTG呈共分离现象。在14＃及28＃家系中均发现了Thr361insA突变，通过家系内关联分析显示Thr361insA突变与家系中HTG呈显著相关。上述突变均未在正常对照中检测到。 3.在新1＃和新3＃家系的先证者中筛查到了Leu286Pro和Ala71Thr突变，其中新1＃家系的先证者是一位39岁男性，其TG为11.9mmol/L；新3＃家系的先证者为一位40岁的男性，其TG为13.0mmol/L，由于Leu286Pro和Ala71Thr突变曾经被报道过，并且均进行了体内及体外的功能研究，显示这两者突变均可以导致其产物LPL活性缺乏，从而使血中TG极度升高。因此考虑Leu286Pro和Ala71Thr突变是这两个家系成员HTG的直接原因。 结论：在成都地区汉族人群T2DM家系中伴HTG患者LPL基因的突变频率较高；部分家系的HTG是由于LPL基因突变直接导致的。 2.野生型人LPLcDNA重组质粒的构建、克隆和鉴定 目的：获取野生型人LPLcDNA重组质粒，为下一步进行LPL基因的体外定点突变及体外表达提供一个必要条件。 方法：逆转录PCR(RT-PCR)法从人的大网膜脂肪组织获取人LPLcDNA基因，选用pcDNA3.1Zeo(+)质粒作为载体，运用基因克隆技术构建野生型人LPLcDNA重组质粒；对重组质粒进行限制性内切酶酶切、PCR以及双向测序鉴定。 结果：经过限制性内切酶酶切及PCR鉴定证实LPL基因已克隆到pcDNA3.1Zeo(+)质粒中，DNA双向测序证实与基因库中LPL基因的序列完全一致。 结论：成功构建了野生型人LPLcDNA重组质粒，为下一步进行LPL基因的体外定点突变及体外表达奠定了实验基础。 3.LPL基因的体外定点突变及体外表达 目的：对LPL基因进行Asn291Ser、Lys312insC、Thr361insA及Asn291Ser+Lys312insC定点突变；同时在体外研究这四个突变LPL基因的功能。 方法：采用定点突变试剂盒对LPL基因进行体外定点突变；采用了阳性脂质体Lipofectamine2000将重组pcDNA3.1Zeo(+)-LPLcDNA质粒导入COS-1细胞；细胞培养分7组：空白对照组即不给予任何干预，阴性对照组即用空质粒pcDNA3.1Zeo(+)进行转染，阳性对照组即用野生型重组质粒进行转染和四个实验组即分别用4个突变型重组质粒进行转染。细胞裂解液及细胞培养基LPL浓度的检测采用的是人LPLELISA试剂盒；细胞裂解液及细胞培养基LPL活性的检测采用的是分光光度计法。 结果：1.通过DNA双向测序证实，除导入的特异突变位点外无其它新的突变产生。突变的pcDNA3.1Zeo(+)-LPLcDNA重组质粒构建成功。 2.用RT-PCR法对细胞裂解液及培养液进行扩增，结果示：除空白及阴性对照孔未扩增出条带外，其余各组均扩增出一条特异性条带，其片段大小为1455bp，说明野生型及突变型重组质粒pcDNA3.1Zeo(+)-LPL基因在真核COS-1细胞中转染成功。 3.对各组细胞裂解液及细胞培养基LPL浓度的检测，结果显示：在细胞裂解液中，野生型LPL转染的COS-1细胞LPL浓度为298±14ng/ml，四组突变的LPL转染的COS-1细胞LPL浓度有轻度下降趋势，但与野生型组相比，均未达到统计学意义；在细胞培养基中，野生型LPL转染的COS-1细胞培养基LPL浓度为277±7ng/ml，四组突变的LPL转染的COS-1细胞培养基LPL浓度显著下降，与野生型组相比，均达到了统计学意义。 4.对各组细胞裂解液及细胞培养基LPL活性的检测，结果显示：在细胞裂解液及细胞培养基中，野生型转染的COS-1细胞LPL活性分别为1.69±0.03和1.47±0.02FFAumol/ml·h；相对于野生型来说，无论是细胞裂解液还是细胞培养基中，四组突变组的LPL活性均发生了显著的降低，其中在Asn291Ser+Lys312insC组未检测到LPL活性，Thr361insA组LPL活性约为野生型的20％，Lys312insC组LPL活性约为野生型的12％以及Asn291Ser组LPL活性约为野生型的60％。 结论：成功地完成了LPL基因的体外定点突变；LPL的Asn291Ser、Lys312insC、Thr361insA及Asn291Ser+Lys312insC四种突变均没有影响到LPL的转录和翻译，但在不同程度上都影响到了LPL向细胞外的分泌，且都显著降低了LPL的活性，四个突变均为功能性突变。

目录

声明

中英文缩略词

前 言

第一分题2型糖尿病家系中高甘油三酯血症患者脂蛋白脂酶基因分子筛查

研究对象

样本收集和处理

材料与方法

结 果

一.LPL基因启动子以及各外显子的PCR圹增

二.LPL基因的SSCP筛查

三.LPL基因的DHPLC筛查

四.LPL基因序列分析结果

五.家系及正常对照者筛查结果

讨 论

小 结

第二分题野生型人LPLcDNA重组质粒的构建、克隆和鉴定

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三分题LPL基因的体外定点突变及体外表达

材料与方法

结 果

1.重组克隆载体pGEM-T-LPL的酶切及PCR鉴定结果

2.重组克隆载体pGEM-T-LPL的双向测序结果

3.重组克隆载体pGEM-T-LPL的定点突变的双向测序结果

4.突变的LPL基因亚克隆入表达载体pCDNA3.1Zeo(+)的酶切及PCR鉴定结果

5.重组质粒pcDNA3.1Zeo(+)-LPL基因在真核细胞中表达

6.突变区域的一级蛋白结构分析

7.突变区域的空间蛋白结构分析

讨 论

小 结

全文总结

参考文献

综述 脂蛋白脂酶的研究进展

参考文献

攻读博士学位期间发表文章

攻读博士学位期间参加会议及所获奖励

致 谢