皮革霉变真菌拮抗菌ZT-229的筛选、鉴定与发酵条件优化

摘要

从成都地区自然霉变的皮革制品中分离纯化到6株霉菌，分别编号为M1、M2、M3、M4、M5和M6。通过形态学观察及生理生化特征初步鉴定为白曲霉M1(A.candidus)、拟青霉M2(Paecilomyces varioti)、黄绿青霉M3(PniciHiumcitreo-viride Biourhe)、黄曲霉M4(Aspergillus-flavus)、产黄青霉M5(Penicilliumchrysogenum Thorn)和黑曲霉M6(Aspergillus．niger)。从西藏地区(吉隆佩古错湖距湖边0.5m，林周澎波农场堆肥地3400m，日喀则孜龙青稞地4000m)采集的土样中初筛得到六株拮抗菌，分别编号为J1、J2、J3、J4、J5和J6，它们对白曲霉M1、拟青霉M2和黑曲霉M3有较好的拮抗作用。J1、J2、J3、J4革兰氏染色为阳性，J5、J6易变；芽孢染色均为阳性，故六株拮抗菌均为芽孢杆菌属(Bacillus)。六株拮抗菌均芽孢囊不明显膨大，芽孢椭圆形或柱状，中生或近中生，生长在葡萄糖营养琼脂上的幼龄细胞，用美蓝淡染色，原生质中没有不着色的颗粒，在7[％]NaCl中生长，石蕊牛奶不产酸，PH5.7生长，V.P阳性，水解淀粉。其中J1、J2、J5、J6兼性厌氧，利用丙酸盐，故初步鉴定为地衣芽孢杆菌(Bac．licheniformis)，J3、J4好氧，不利用丙酸盐，故初步鉴定为为枯草芽孢杆菌(Bac.subtilis)。用杯碟法复筛，得到一株枯草芽孢杆菌(Bac.subtilis)ZT-229对白曲霉：M1、拟青霉M2和黑曲霉M3有良好的广谱拮抗作用。 采用文献报道的细菌的通用引物，以菌株ZT-229的总DNA为摸板扩增出1500bP左右的16SrDNA的片段，将PCR片段进行TA克隆到载体pGEM-T上，转化E.coli感受态细胞JMl09得到转化子，选取阳性克隆的重组子进行序列测定，选用通用测序引物T7、SP6测定2个反应，每个反应测800bP左右，将两个序列结果拼接为完整的16SrDNA序列，为1，499bp。将菌株ZT-229的16S rDNA序列在GenBank中进行BLAST，所获得的同源序列均为芽孢杆菌科的16S rDNA序列，其中相似性最高的为B.subtilis属的菌株。该序列与B.subtilis属的几个模式B.subtilis strain BSK,B.subtilis strain C2,B.subtilis strain M03，B.subtilis strainIDCCllO3的相似性分别为99.8％，99.4％，98.5％和96.5％。在此基础上以一株假单胞菌(Pseudomonas)16S rDNA序列为外种群构建系统发育树。由于GenBank中获得的序列长短不同，为了获得更可信的系统发育树，根据CLUSTAL的结果将比对好的序列均截短为相当于ZT-229 16S rDNA序列62bp-1430 bp的片段．应用PHLIP软件包得到以16S rDNA序列为基础的系统发育树(分支旁的数值为聚类的置信度[％])。 本实验对影响枯草芽孢杆菌ZT-229(Bac.subtilis)摇瓶发酵生产抑菌活性物质的相关因子：豆饼粉水提时间、水提液浓度、磷酸盐浓度、金属离子、发酵培养基初始pH值、接种量和接种龄等采用单因素试验进行了研究。在参阅相关文献和单因子试验基础之上，选取pH、接种量、Mg<'2+>、磷酸盐和转速五个因素，各取四个水平，进行L<,16>(4<'5>)正交试验。由方差分析可知，发酵培养基pH值对产抑菌活性物质影响极显著，磷酸盐缓冲液浓度对产抑菌活性物质性影响不显著。当发酵初始pH值7.5，接种量10[％]，MgS0<,4>·7H<,2>O 0.04[％]，磷酸盐缓冲液浓度为0.20mol/L,摇床转速为120r/min时，产抑菌活性物质最高，抑菌圈直径为4.18cm。

目录

表格目录及图形目录

第一章皮革霉变真菌的分离鉴定及拮抗菌的筛选与鉴定

第二章真菌拮抗菌株ZT-229的16S rDNA序列测定及系统发育学分析

第三章真菌拮抗菌株ZT-229的发酵条件优化

文献综述

致谢

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